Estudo da influência de aminas putrefativas na análise de anfetaminas por métodos imunoenzimáticos, em amostras de sangue post mortem

Abstract

In toxicology laboratories, with a high number of requests for research on drugs of abuse, the use of immunoenzymatic screening methods is essential to allow obtaining results quickly and with adequate sensitivity. This methodology is used in the SQTF-DC of the INMLCF, I.P. since 2003 and has been continuously improved in order to adapt it to different types of samples with toxicological interest, including post-mortem blood.Obtaining positive results using immunoenzymatic screening methods requires their subsequent confirmation through methods capable of providing structural information on the substances of interest, such as gas or liquid chromatography systems coupled to mass spectrometry detectors, which is why the occurrences of false positive results in the screening tests translate into an unnecessary consumption of material and human resources.The objective of this work was to carry out a bibliographic review of the existing literature related to the selection of the main biological samples used in Forensic Toxicology, in particular blood, the matrix that was used in this study, and how its putrefaction can lead to the release of compounds that induce the production of false positives when using enzyme-linked immunosorbent screening tests. In this way, it was intended to identify the substances potentially generating these results and, eventually, promote the adjustment of the cut off concentration values currently used by the SQTF, in order to reduce or eliminate the occurrence of false positive results in post mortem blood samples.In this sense, the work includes a theoretical part of a literature review and an evaluation of the drugs detected in the SQTF-DC between 2018-2020 associated with cases of false positives in the enzyme-linked immunosorbent method for amphetamine screening.It also includes the practical part itself, where several blood samples were fortified with known concentrations of putrefactive amines and drugs and analyzed according to the procedures in force in the SQTF-DC of the INMLCF, using an Evolis Twin Plus autoanalyser, to screen for amphetamines, with a kit from OraSure Technologies, Inc., specifically for the analysis of amphetamines.The effect of the preservative/anticoagulant present in the blood sample used as a blank sample was also tested and an in vitro assay was performed with a post mortem sample to verify the effect of sample degradation (with and without preservative) on the results obtained in this procedure.For the study of matrix interference, tests were also carried out on serum samples fortified with the selected substances, especially with cadaverine and putrescine.The results obtained allow us to conclude that tyramine gives rise to a false positive result when at concentrations above 10 µg/mL and that indole and phenol also give rise to false positive results at concentrations above 125 µg/mL.Cadaverine and putrescine, up to a concentration of 200 µg/mL, did not present any type of interference in these assays, even when analyzed together.The tested drugs also did not show any interference, even being analyzed at concentrations with high toxicity.Regarding the sample stability studies, after almost 6 months, the post-mortem blood sample left at room temperature did not interfere with amphetamine screening (with and without sodium fluoride). The remaining assays, in blood with SAGM as a preservative and in serum, also did not cause interference.We can conclude that the method used is quite effective in the screening of amphetamines and that false positive results will most likely occur due to the characteristics of the blood during the process of putrefaction of the corpse and not after collection. Having also demonstrated high levels of specificity, the results obtained lead us not to suggest changing the cut off concentration for the analysis of amphetamines in post-mortem blood by the enzyme immunoassay performed according to the PE-STF-C-104_rev02 test procedure.

Em laboratórios de toxicologia, com um elevado número de pedidos de pesquisa de drogas de abuso, o recurso a métodos de rastreio imunoenzimáticos é essencial para permitir a obtenção de resultados de forma rápida e com uma sensibilidade adequada. Esta metodologia é utilizada no SQTF-DC do INMLCF, I.P. desde 2003 e tem sido continuamente melhorada com o objetivo de adequá-la a diversos tipos de amostras com interesse toxicológico, incluindo o sangue post mortem.A obtenção de resultados positivos com recurso a métodos de triagem imunoenzimáticos, obriga à sua posterior confirmação através de métodos capazes de fornecer informação estrutural sobre as substâncias de interesse como, os sistemas de cromatografia gasosa ou líquida acoplados a detetores de espectrometria de massa, motivo pelo qual as ocorrências de resultados falso positivos nos ensaios de triagem traduzem um consumo desnecessário de recursos materiais e humanos.O objetivo deste trabalho consistiu na realização de uma revisão bibliográfica da literatura existente relacionada com a seleção das principais amostras biológicas utilizadas em Toxicologia Forense, em particular o sangue, matriz que foi a utilizada neste estudo, e em como a sua putrefação pode conduzir à libertação de compostos que induzem a produção de falsos positivos quando se utilizam testes de rastreio imunoenzimáticos. Pretendia-se deste modo identificar as substâncias potencialmente geradoras desses resultados e, eventualmente promover o ajuste dos valores de concentração cut off atualmente utilizados pelo SQTF, a fim de reduzir ou eliminar a ocorrência de resultados falso positivos nas amostras de sangue post mortem.Neste sentido, o trabalho inclui uma parte teórica de revisão bibliográfica da literatura e de uma avaliação dos fármacos detetados no SQTF-DC entre 2018-2020 associados aos casos de falsos positivos no método imunoenzimático para a triagem de anfetaminas.Incluiu também a parte prática propriamente dita onde se fortificaram diversas amostras de sangue em concentrações conhecidas de aminas putrefativas e de fármacos e analisaram-se segundo os procedimentos em vigor no SQTF-DC do INMLCF, usando um autoanalisador Evolis Twin Plus, para triagem de anfetaminas, com um kit da OraSure Technologies, Inc., específico para a análise de anfetaminas.Foi ainda testado o efeito do conservante/ anticoagulante presente na amostra de sangue usada como amostra branco e foi feito um ensaio in vitro com uma amostra post mortem para verificar o efeito de degradação da amostra (com e sem conservante) nos resultados obtidos neste procedimento.Para o estudo da interferência da matriz foram também realizados ensaios em amostras de soro fortificadas com as substâncias selecionadas, em especial com a cadaverina e a putrescina.Os resultados obtidos permitem concluir que a tiramina dá origem a um resultado falso positivo quando em concentrações acima de 10 µg/mL e que o indol e o fenol originam também resultados falso positivos para concentrações acima de 125 µg/mL.A cadaverina e a putrescina, até uma concentração de 200 µg/mL, não apresentaram qualquer tipo de interferência nestes ensaios, mesmo quando analisadas em conjunto.Os fármacos testados também não apresentaram qualquer interferência, mesmo sendo analisados em concentrações com elevada toxicidade.Relativamente aos estudos de estabilidade da amostra, após quase 6 meses, a amostra de sangue post mortem deixada à temperatura ambiente, não produziu interferência na triagem de anfetaminas (com e sem fluoreto de sódio). Os restantes ensaios, em sangue com SAGM como conservante e em soro, também não originaram interferências.Podemos concluir que o método utilizado é bastante eficaz na triagem de anfetaminas e que muito provavelmente resultados falsos positivos ocorrerão pelas características do sangue durante o processo de putrefação do cadáver e não após a colheita. Tendo também demonstrado ter elevados níveis de especificidade, os resultados obtidos levam a não sugerir efetuar a alteração da concentração cut off para a análise de anfetaminas em sangue post mortem pelo método imunoenzimático efetuado de acordo com o procedimento de ensaio PE-STF-C-104_rev02.