Evaluating Photodynamic Therapy's usefulness in the treatment of retinoblastoma

Abstract

Apesar de ser considerada uma doença rara, o retinoblastoma é a neoplasia intraocular mais comum da infância, apresentando uma taxa de incidência de aproximadamente 9000 crianças por ano, a nível mundial. A origem dos tumores que caracterizam esta doença está associada a mutações no gene RB1, resultantes de alterações genéticas em células da linha germinativa e em células somáticas da retina. O plano de tratamento do retinoblastoma é um algoritmo complexo que visa, prioritariamente, preservar a saúde ocular e otimizar a visão residual dos pacientes. No entanto, as modalidades terapêuticas utilizadas incluem abordagens mutagénicas, como é o caso da quimioterapia e da braquiterapia, que estão associadas à incidência de neoplasias secundárias, posteriormente na vida do paciente. Assim, o desenvolvimento e aplicação de terapias não mutagénicas seria extremamente significativo para o tratamento do retinoblastoma.A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento indolor, não mutagénica e minimamente invasiva, que apresenta potencial para tratar crianças afetadas por esta doença. Baseia-se na administração de um fotossensibilizador, que por si só não apresenta efeito farmacológico, e na sua ativação seletiva, incitada pela irradiação do local do tumor com luz visível de comprimento de onda apropriado. Recentemente, foi desenvolvido um grupo aprimorado de moléculas fotossensibilizadoras que demonstrou alta eficiência no tratamento de vários tipos de cancro. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia e segurança da utilização destas novas clorinas de anel fundido como tratamento do retinoblastoma, através de um sistema in vitro e de um modelo animal ortotópico.A resposta de células cancerígenas de retinoblastoma ao tratamento fotodinâmico com três fotossensibilizadores (Px1, Px2 e Px3) foi avaliada em termos de atividade metabólica, através dos ensaios MTT e Alamar Blue. A viabilidade, morte celular e paragem induzida do ciclo celular também foram avaliadas através de técnicas de citometria de fluxo e de microscopia. Posteriormente, a molécula que se demonstrou mais promissora foi selecionada para a realização de estudos in vivo. Estas experiências foram realizadas com o propósito de avaliar a remissão do tumor e a estrutura/ função da retina após o tratamento. Para isso, foram utilizadas várias técnicas, tais como estudos de bioluminescência, tomografia de coerência ótica, eletrorretinogramas e imunohistoquímica/microscopia de fluorescência.Os estudos de proliferação celular demonstraram que, embora os três fotossensibilizadores apresentem efeitos antiproliferativos em células cancerígenas de retinoblastoma, esse efeito citotóxico é dependente da irradiação. Também foi possível verificar que o Px1 é o mais eficaz dos três fotossensibilizadores, no que toca à diminuição da viabilidade de células do retinoblastoma, atuando de forma dependente da dose administrada. Estudos de citometria de fluxo também demonstraram que o tratamento com Px1 induz um pico na fase pré-G0/G1 do ciclo celular de células de retinoblastoma. Embora a TFD com Px1 e Px3 tenha provocado a diminuição da viabilidade celular numa linha celular de epitélio pigmentado da retina, in vitro, estudos in vivo demonstraram que a terapia fotodinâmica com Px1 não influencia a função ou resposta das células da retina a estímulos luminosos, demonstrando que esta terapia não provoca danos nas células da retina. Ensaios realizados em modelos animais ortotópicos de retinoblastoma também demonstraram que, em estados iniciais da doença, este tratamento é eficaz na redução do tamanho dos tumores intraoculares. Os resultados também indicam que as dimensões do tumor voltam a aumentar ligeiramente uma semana após o tratamento, o que sugere que um prognóstico melhor seria alcançado através da aplicação de mais do que uma sessão de tratamento. Estudos de imunohistoquímica também revelaram que a TFD realizada com Px1 diminui o índice de proliferação de células cancerígenas de retinoblastoma. Em suma, este trabalho confirmou o potencial citotóxico de um dos três fotossensibilizadores propostos, a dihidroximetil-clorina Px1, para células de retinoblastoma, tanto in vitro como in vivo. Embora estes sejam resultados preliminares, revelam que a utilização de Px1 em terapia fotodinâmica demonstra potencial no tratamento das lesões intraoculares que caracterizam o retinoblastoma.

Despite being considered a rare disease, retinoblastoma is the most common intraocular malignancy of childhood, with an incidence rate of approximately 9000 children per year worldwide. The origin of the tumors that characterize this disease is associated with mutations in the RB1 gene, which may result from genetic alterations in cells of the germline and somatic retinal cells. The management of retinoblastoma is a complex algorithm that aims to preserve eye health and optimize residual vision. However, treatment modalities include mutagenic approaches, such as chemotherapy and brachytherapy, which are associated with the incidence of secondary malignancies later in life. Hence, the development of non-mutagenic therapies for retinoblastoma is of paramount importance. Photodynamic therapy (PDT) is a painless, non-mutagenic, and minimally invasive treatment modality with the potential to treat children affected by this disease. It is based on the administration of a photosensitizer, which presents no pharmacological effect per se. Then, its local activation is achieved by irradiating the tumor site with visible light of the appropriate wavelength. Recently, an improved group of photosensitizer molecules were developed and showed high efficacy in the treatment of various types of cancer. This work aimed to assess these new ring-fused chlorins' effectiveness and safety as a retinoblastoma treatment through an in vitro system and an orthotopic animal model. The response of retinoblastoma cancer cells to PDT treatment using three photosensitizers (Px1, Px2, and Px3) was evaluated in terms of metabolic activity through MTT and Alamar Blue assays. Viability, cell death, and induced cell cycle arrest were also assessed by flow cytometry and light microscopy. The molecule displaying the most promising results was then selected for in vivo studies. These experiments were performed to assess tumor remission, as well as retinal structure and function after treatment. To achieve this, several techniques were performed, such as bioluminescence imaging, optical coherence tomography, electroretinograms, and immunohistochemistry/fluorescence microscopy.Cell proliferation studies have demonstrated that, while all three photosensitizers present anti-proliferative effects in retinoblastoma cancer cells, this cytotoxic effect is dependent upon irradiation. It is also possible to verify that Px1 is the most effective of the three photosensitizers at decreasing retinoblastoma cells' viability, working in a dose-dependent matter. Flow cytometry studies have also shown that Px1 induces a peak in the pre-G0/G1 phase of the cell cycle of retinoblastoma cells. Although PDT with Px1 and Px3 resulted in decreased cell viability in a retinal pigmented epithelium cell line in vitro, in vivo studies have shown that photodynamic therapy with Px1 does not influence retinal thickness nor the responsiveness of retinal cells to light stimuli, providing evidence that this therapy does not damage retinal cells. Experiments carried out in orthotopic animal models of retinoblastoma have also demonstrated that, in early stages of the disease, this treatment is effective in reducing the size of intraocular tumors. Results also indicate a slight increase in tumor mass one week after treatment, suggesting that a better prognosis would be achieved with more than one treatment session. Immunohistochemistry studies have also shown that Px1-based PDT decreases the proliferation index of retinoblastoma cancer cells. Taken together, this work confirmed the cytotoxic potential of one of the three photosensitizers, the dihydroxymethyl chlorin Px1, towards retinoblastoma cells in vitro and in vivo. Although this work consists of preliminary data, the achieved results demonstrate that Px1-mediated photodynamic therapy has potential in treating retinoblastoma intraocular lesions.