Time-Gated Fluorescence Lifetime Microscope with Light Sheet Illumination

Abstract

Optical imaging technologies can assess the metabolic activity of biological tissues. This study focus on developing a system capable of studying thick ocular tissues, like corneas. The system was based on non-invasive fluorescence lifetime imaging microscopy techniques. These techniques may help detect dysfunction and prevent disorders from developing into irreversible states.In order to image fluorescence between 520 and 570 nm in thick biological tissues, this project focused on the development of a Time-Gated fluorescence lifetime microscope with light-sheet illumination at 440 nm. The microscope was characterized through testing of its optical and timing properties. The system has an axial resolution of around 8.6 µm. This result represents an improvement between 14 to 42% over what was initially required. The measured fluorescence lifetime has a relative accuracy error that ranges from 3 to 13%, depending on the used gate width. Animal corneas and induced fluorescent onion cells were imaged to test the microscope. The results obtained did not fulfill the main objective of this project.Except for the optical sectioning performance, the acquired values satisfied the system requirements. The implemented microscope, however, performs as expected and enables assessment of its use for imaging biological tissues. In order to image thick tissues with good contrast, the microscope must be modified to further decrease the light-sheet thickness, which helps to improve the optical sectioning.

As tecnologias de imagiologia ótica são ferramentas que permitem avaliar a atividade metabólica de tecidos biológicos. Este estudo foca-se no desenvolvimento de um sitema capaz de adquirir imagens de tecidos oculares espessos como, por exemplo, cóneas. O sistema é baseado em técnicas microscopia de tempo de vida de fluorescência. Estas técnicas poderão ajudar a detetar disfunções e previnir que distúrbios possam progredir para estados irreversíveis.De modo a adquirir imagens de fluorescência entre 520 e 570 nm em tecidos biológicos espessos, este projecto focou-se no desenvolvimento de a um microscópio de tempo de vida de fluorescência com iluminação light-sheet a 440 nm.O microscópio foi caracterizado com recurso a testes que avaliaram as suas propriedades ópticas e de temporização. O sistema tem uma resolução axial de cerca de 8,6 µm. Este resultado representa uma melhoria entre 14 a 42% relativamente ao que era inicialmente requerido. O tempo de vida de fluorescência medido, tem um erro relativo de exactidão que varia de 3 a 13%. Foram utilizadas córneas de animais e células de cebola com fluorescencia induzida para testar o microscópio. Os resultados obtidos não cumprem o objetivo principal deste projeto.Constata-se que, excetuando o desempenho do seccionamento óptico, os valores medidos satisfazem com os requisitos do sistema. Para obtenção de imagens de tecidos espessos com bom contraste, o microscópio deve ser melhorado para diminuir ainda mais a espessura da light-sheet e melhorar o seccionamento óptico.