Impact of maternal diabetes on offspring retinal structure and function

Abstract

A diabetes durante a gravidez está associada a um risco aumentado para distúrbios do neurodesenvolvimento na descendência, com um impacto negativo a nível do cérebro, e dando origem a efeitos adversos de curto e longo prazo. A retina, que faz parte do sistema nervoso central e é considerada uma extensão do cérebro, pode também ser vulnerável à diabetes durante a gravidez, desconhecendo-se os seus efeitos em termos do impacto no desenvolvimento, estrutura e função da retina.Com este trabalho, pretendeu-se avaliar o impacto da diabetes materna no desenvolvimento, estrutura e função da retina, com foco no período da infância. Além disso, teve-se como objetivo também esclarecer se a retina de machos e fêmeas tem uma diferente suscetibilidade à hiperglicémia durante o desenvolvimento. Ao mesmo tempo, pretendeu-se analisar se a administração de insulina à mãe pode prevenir alterações na retina da descendência induzida pela diabetes materna.O modelo animal de diabetes tipo 1 pré-gestacional foi obtido através de uma única injeção intraperitoneal de estreptozotocina (STZ: 45 mg/kg) em ratos fêmea em jejum. Três dias após a injeção de STZ foi introduzido subcutaneamente um implante de insulina (~1 U/dia; Linplant®) a um subgrupo de fêmeas diabéticas. Os níveis de glicémia das fêmeas foram monitorizados para confirmar a presença de diabetes durante o período de gestação e para confirmar a normoglicémia em mães com implante de insulina e controlos. O peso das mães também foi monitorizado antes e durante o período de gestação. Após o nascimento, foi contado o número de crias por ninhada e os descendentes foram monitorizados durante os dias seguintes para avaliar o dia de abertura dos olhos. O peso e a glicémia dos machos e fêmeas descendentes foram avaliados no dia pós-natal (P)7 e 21. A estrutura e função da retina foram avaliadas in vivo por meio de tomografia de coerência ótica e eletrorretinograma, respetivamente, a P21. Amostras de tecido retiniano foram utilizadas para análise molecular e celular por Western Blot e imunohistoquímica, em ambos os períodos da infância.Os valores de glicémia foram semelhantes nos descendentes de mães diabéticas e controlos a P7 e P21. No entanto, os descendentes de mães diabéticas apresentaram peso inferior durante o período da infância, sendo o tratamento da mãe com insulina capaz de prevenir totalmente esta alteração a P7, mas apenas parcialmente a P21. A diabetes materna induziu também um atraso no dia de abertura dos olhos da descendência quando comparado com os controlos. Curiosamente, o tratamento das mães diabéticas com insulina antecipou a abertura dos olhos dos descendentes comparativamente aos controlos, sugerindo uma maturação precoce.A nível molecular, o conteúdo de proteínas sináticas na retina não foi alterado nos descendentes de mães diabéticas quando comparados com os descendentes de mães controlo, tanto a P7 como a P21. No entanto, nas descendentes fêmea de mães diabéticas houve tendência para uma redução dos níveis de sinapsina a P7. O número de células ganglionares da retina não foi afetado pela diabetes materna e o número e morfologia das células da microglia não sofreram alterações.Relativamente à estrutura da retina, a diabetes materna induziu uma redução na espessura da camada dos segmentos internos e externos dos fotorreceptores tanto em descendentes machos como em fêmeas, e uma redução na espessura da camada de fibras nervosas, camada das células ganglionares e camada plexiforme interna, a P21, mas apenas nas fêmeas. Este efeito não foi associado a perda de células ganglionares e foi prevenido pela administração de insulina às mães diabéticas. Em relação à função retiniana, a diabetes materna induziu uma diminuição da amplitude da 1º harmónica do flicker e da onda-b escotópica em descendentes do sexo masculino, indicando disfunção dos cones e células bipolares, respetivamente, tendo o tratamento com insulina prevenido estas alterações. As fêmeas descendentes de mães diabéticas parecem ser resilientes a alterações na função neuronal da retina. No entanto, os níveis da proteína arrestina na retina encontram-se diminuídos, um efeito prevenido pela administração de insulina. Não se observaram alterações nos níveis de arrestina em descendentes do sexo masculino.Resumindo, a exposição a hiperglicémia durante a gravidez atrasou o dia de abertura dos olhos da descendência, sugerindo um impacto no desenvolvimento. Também afetou negativamente a retina da descendência, induzindo uma redução da espessura de várias camadas retinianas, com impacto evidente na função de células bipolares e fotorreceptores em machos, e uma redução nos níveis de arrestina em fêmeas. Os resultados mostram uma elevada suscetibilidade dos fotorreceptores à hiperglicémia, sendo estes neurónios particularmente vulneráveis à diabetes materna. A administração de insulina preveniu essas alterações.

Diabetes during pregnancy is associated with increased risk of neurodevelopmental disorders in the offspring, negatively impacting the offspring brain and giving rise to short- and long- term adverse effects. The retina, which is part of the central nervous system (CNS) and is considered an extension of the brain, may also be vulnerable to diabetes during pregnancy, with unknown effects in its development, structure, and function.With this work, we intended to evaluate the impact of maternal diabetes on retina development, structure and function, focusing on infancy period. Additionally, since maternal diabetes was already described to have a sex-specific impact in the offspring’s brain, we aimed to clarify if males and females’ retinas have a different vulnerability to hyperglycemia during development. At the same time, we aim to address if dam treatment with insulin, the gold standard therapy for diabetes, can prevent any offspring retinal alteration induced by maternal diabetes.Pre-gestational type 1 diabetes (T1D) animal model was achieved by a single intraperitoneal (IP) injection of streptozotocin (STZ: 45 mg/kg) in fasting female rats. Three days after STZ injection, a subset of diabetic females received an insulin implant (~1 U/day; Linplant®) subcutaneously. Dams’ glycemia was monitored to confirm diabetes during gestation period and to confirm normoglycemia in dams with insulin implant and controls. Weight was also monitored before gestation and during gestation period. After birth of the offspring, the number of pups per litter was counted and offspring were closely monitored during the following days to evaluate eye opening day. Male and female offspring weight and glycemia of control (CTRL), diabetic (STZ) and diabetic treated with insulin (STZ+INS) dams were evaluated at postnatal day (P)7 and 21. Retina structure and function were evaluated in vivo by optical coherence tomography (OCT) and electroretinogram, respectively, at P21. Retinal tissue samples were used for molecular and cellular analysis by Western Blot and immunohistochemistry (IHC), in both time points.Glycemia values were similar between diabetic and controls offspring at P7 and P21. However, the offspring of diabetic dams presented inferior weight during the infancy period being insulin treatment to the dam able to fully prevent this alteration at P7, but only partially at P21. Maternal diabetes also delayed the offspring eye opening day when compared to controls. Interestingly, insulin treatment of the diabetic dams anticipated eye opening of the pups comparing to control, suggesting increased maturation.At a molecular level, the content of synaptic proteins was not altered in the offspring of diabetic dams when compared with controls at P7 and P21. However, in the female offspring of diabetic dams, there was a tendency for reduced synapsin levels at P7. The number of retinal ganglion cells (RGCs) was not affected by maternal diabetes and the number and morphology of microglia cells did not suffer major changes at both timepoints.In terms of retinal structure, maternal diabetes induced a reduction in the photoreceptor inner and outer segments layer in both males and females and a reduction in the thickness of the combined nerve fiber layer (NFL), ganglion cell layer (GCL) and inner plexiform layer (IPL), at P21, but only in females. This effect was unrelated with ganglion cell loss and was prevented by insulin administration to the diabetic dams. Regarding retinal function, maternal diabetes induced a decrease in amplitude of flicker’s 1st harmonic and in the scotopic b-wave in male offspring, indicating cone and bipolar cell dysfunction, respectively, being insulin treatment able to prevent the alterations. Female offspring of diabetic dams appear to be resilient to alterations in retinal neuronal function. Nevertheless, cone arrestin protein levels were decreased, an effect prevented by insulin administration and not observed in male offspring of diabetic dams.Summarizing, the exposure to hyperglycemia during pregnancy delays eye opening day, suggestive of impaired development, and negatively impacts the offspring retina, namely, by inducing a thinning of several retinal layers with evident impact in terms of bipolar cell and photoreceptor function in males, and a reduction in arrestin levels in females. The results show a high susceptibility of photoreceptors to hyperglycemia, being these neurons particularly vulnerable to maternal diabetes, while insulin administration is able to prevent these alterations.