Interkingdom Microbial Biofilm And The Quest For Novel Therapies

Abstract

Interações entre bactérias e fungos são comuns na natureza, assim como em ambientes clínicos, e por vezes estas interações ocorrem em forma de biofilmes, que consistem em comunidades de microorganismos que se encontram ligados superfícies abióticas e bióticas. Os biofilmes polimicrobianos toleram mais os antibióticos do que biofilmes de apenas de uma espécie, o que leva a limitação no uso de terapêuticas convencionais. A relevância biológica destas interações, na maioria, ainda é desconhecida. O objetivo principal desde estudo era a avaliação das interações microbianas no decorre da formação de biofilme, e o impacto que podem ter no tratamento da infeção. Os objetivos específicos eram: investigar as interações de sinergismo ou antagonistas entre bactérias e fungos Acinetobacter spp. and Candida spp como modelo de estudo, e avaliar o efeito de antibióticos na formação de biofilmes.Os biofilmes foram desenvolvidos em diversos meios de cultura, assim como foram usadas diferentes estirpes de Acinetobacter spp. and Candida spp., e a metodologia usada consistiu em avaliar a biomassa formada em biofilmes simples e polimicrobianos, usando o método de cristal violeta depois de 24h de incubação; medir a biomassa na presença e na ausência de antimicrobianos; avaliar a virulência de C. albicans através da observação ao microscópio da formação de hifas quando em contacto com Acinetobacter spp.; e avaliar a expressão de genes (ompA and csu) que se encontram associados à formação de biofilmes, usando a técnica de RT-qPCR. Observou-se que o meio de cultura e a quantidade relativa de células (bactéria-fungo) que é usada pode influenciar a produção de biofilme. A observação microscópica demostrou que C. albicans YP0037 formou pseudo-hifas quando em contacto com A. baumannii 319 e A. bereziniae 118, no entanto C. tropicalis M152540979 formou pseudo-hifas estando sozinha ou em contacto com as Acinetobacter spp. A adição de concentrações sub-inibitórias (sub-MICs) de ciprofloxacina antes da incubação do biofilme demonstrou que os biofilmes polimicrobianos de A. baumannii 319 e C. albicans YP0037, e C. glabrata M14331produziram mais biomassa do que os biofilmes de cada espécies sozinhas. No entanto, C. tropicalis M152540979 demostra uma redução na produção de biomassa. A adição de concentrações sub-inibitórias (sub-MICs) de ciprofloxacina antes da incubação do biofilme demonstrou que os biofilmes polimicrobianos de A. bereziniae 118 e C. albicans YP0037, e C. glabrata M14331e C. tropicalis M152540979 levam a uma redução na formação de biofilme. A adição de sub-MICs depois do biofilme ter 8 horas de formação levou a um aumento na produção de biomassa nos biofilmes. Não foi possível concluir se a expressão dos genes ompA e csu são ou não significantes em Acinetobacter spp. Alguns estudos afirmam que existe uma interação antagonista entre A. baumannii e C. albicans e que isso levaria a inibição do biofilme, no entanto os nossos resultados para Acinetobacter spp quando em contacto com Candida spp. demostram o oposto. Diversas metodologias podem explicar esta diferença nos resultados, como o facto de serem diferente espécies e estirpes e isso levar a que não se comportem de maneira igual, e isso realça um problema que é o tratamento destes biofilmes polimicrobianos. A virulência dos fungos pode aumentar quando se encontram em biofilmes, assim como a adição de antibióticos pode interferir com a produção de biomassa, aumentando-a, mesmo quando o biofilme já se encontra formado. Em conclusão, este estudo serve para demostrar a complexidade que são as interações nos biofilmes polimicrobianos, e como isso pode afetar a terapêutica convencional, assim como realçar a urgência para o estudo destas interações de forma a descobrir novos alvos terapêuticos.

Bacterial-fungal interactions are common in nature and clinical environments. These interactions usually occur in a form of biofilm, which is a community of microorganisms attached to an abiotic or biotic surface. Polymicrobial biofilms are more tolerant to antimicrobials than single species biofilm, limiting conventional drug therapy. The biological relevance of microbial interactions remains largely unknown. The main objective of this study was to evaluate the microbial interaction in a biofilm formation and the impact in the treatment of infection. The specific objectives were: to investigate the synergetic or antagonist interaction between bacteria and fungi, using Acinetobacter spp. and Candida spp. in a biofilm model, and to evaluate the effect of antibiotics in the biofilm formation. Biofilms were formed in diverse culture media with different strains of Acinetobacter spp. and Candida spp. The methodology used was: evaluation of biomass in single species and mixed biofilms by using the crystal violet method after 24h of incubation; measurement of biomass in the absence and presence of antimicrobials; assessment of C. albicans virulence by microscopic observation of the formation of hyphal in the absence and presence of Acinetobacter spp.; and evaluation of expression of Acinetobacter spp. biofilm-associated genes (ompA and csu) by RT-qPCR. We observed that the medium and the relative quantity of cells used can influence the biofilm production. Microscopic observation showed that C. albicans YP0037 formed pseudohyphae when in contact with A. baumannii 319 and A. bereziniae 118, while C. tropicalis M152540979 developed pseudohyphae in the presence and absence of the bacteria. Addition of sub-MIC of ciprofloxacin before biofilm incubation showed that mixed biofilms of A. baumannii 319 with C. albicans YP0037 and C. glabrata M14331 produced more biomass than single species biofilm; however, with C. tropicalis M152540979, biofilm formation was reduced. Addition to mixed biofilms of A. bereziniae 118 with C. albicans YP0037, C. glabrata M14331 and C. tropicalis M152540979, lead to a reduction in the biofilm formation. Sub-MICs of gentamicin added to an 8 hour-biofilm lead to an increase of biomass of the mixed biofilm. There was no possibility to conclude if the expression of ompA and csu was significant in Acinetobacter spp. Some studies showed that the interaction between A. baumannii and C. albicans are antagonistic, leading to the inhibition of biofilm, which is in contrast with our results for Acinetobacter spp.- when in contact with Candida spp.. Different methodologies can explain this observation or different strains/species do not behave identically, which accounts for the difficulty of treatment of polymicrobial infections. Moreover, virulence of fungi can be enhanced in mixed biofilms. Antibiotics can interfere with biofilm production, even when already formed, increasing the biomass and challenging the treatment of polymicrobial infections. Overall, this study demonstrates the complex interactions of polymicrobial biofilms and how they can affect conventional therapy, urging for the study of mechanistic interactions to find new therapeutic targets.