Effect of blueberry juice supplementation in a rat model of prediabetes: control diets and molecular mechanisms

Abstract

A pré-diabetes é um estado intermédio entre a tolerância normal à glucose e a diabetes mellitus tipo 2 (DMT2), tem a obesidade como um dos principais fatores de risco e está associada a diversas complicações, incluindo a esteatose hepática. A progressão da esteatose hepática tem sido associada à disfunção da resposta ao stress do retículo endoplasmático (RE) e da autofagia. O estudo da pré-diabetes é dificultado pela escassez de modelos animais, sendo a maioria destes induzidos por dietas refinadas com um elevado teor de lípidos e/ou de hidratos de carbono. Estas dietas refinadas são geralmente comparadas com dietas controlo não refinadas; contudo, estas diferem marcadamente na composição nutricional, especialmente no conteúdo de fibras e fitoestrógenio, o que pode levar a diferenças fenotípicas inesperadas e a interpretações erróneas dos resultados. Embora as intervenções farmacológicas sejam indispensáveis para a controlo da DMT2, na pré-diabetes - um estádio em que a doença ainda não está totalmente estabelecida - as modificações do estilo de vida são recomendadas como intervenções de primeira linha. Os frutos vermelhos, incluindo o mirtilo, têm sido associados a efeitos benéficos em diversas condições, incluindo em doenças metabólicas e cardiovasculares, em função dos seus efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios, hipolipemiantes e sensibilizadores da insulina, entre outros. Considerando que a resistência à insulina, a dislipidemia, o stress oxidativo e a inflamação são os principais promotores da progressão da pré-diabetes e do desenvolvimento das suas complicações, a utilização do mirtilo pode ser uma intervenção nutracêutica valiosa nesta fase precoce da doença. No entanto, o potencial do mirtilo na prevenção da pré-diabetes em condições relevantes para a patogénese humana, bem como os mecanismos moleculares envolvidos permanecem em grande parte inexplorados.Este projeto tem como principais objetivos: 1) avaliar as alterações metabólicas, histológicas e moleculares num modelo animal de pré-diabetes induzidas por uma dieta rica em gordura e sacarose (HFHS), em comparação com dois tipos de dietas controlo e 2) identificar os mecanismos moleculares responsáveis pelos potenciais efeitos protetores da suplementação de sumo de mirtilo (BJ) contra a progressão da pré-diabetes.Ratos Wistar machos foram alimentados durante 24 semanas com uma dieta refinada HFHS indutora de pré-diabetes, uma dieta refinada (equiparada em nutrientes) com baixo teor em gordura (LFD) e uma dieta controlo-padrão não refinada (CD). Um quarto grupo foi alimentado com uma dieta HFHS suplementada com BJ (HFHS + BJ) a partir da 16ª semana, momento em que o fenótipo pré-diabético foi alcançado. O peso corporal foi monitorizado ao longo de todo o estudo. Após o sacrifício, o fígado e os depósitos de tecido adiposo branco epididimal (TABe) e castanho interescapular (TACi) foram recolhidos e utilizados para análise histológica. O sangue foi utilizado para análise bioquímica. Marcadores de termogénese, stress do RE e de autofagia foram avaliados no TACi e no fígado, respetivamente, através da quantificação da expressão de algumas proteínas por Western blot.Os animais alimentados com HFHS apresentaram características de pré-diabetes, incluindo aumento da adiposidade e do peso corporal, hiperinsulinemia pós-prandial, intolerância à glicose e esteatose hepática, em paralelo com um aumento dos marcadores de termogénese UCP-1 e PGC-1α no TACi. Surpreendentemente, quando comparados com a CD, os animais alimentados com LFD apresentaram anomalias metabólicas consideráveis, tais como o aumento da massa de TABe, hiperinsulinemia pós-prandial, intolerância à glicose e esteatose hepática. A desregulação da resposta ao stress do RE e da autofagia foram também observadas nos grupos HFHS e LFD, quando comparados com o grupo CD. O consumo de BJ não afetou o ganho de peso corporal e adiposidade, porém atenuou a intolerância à glicose e inibiu as alterações induzidas pela dieta nos marcadores de termogénese, de stress do RE e autofágicos. Paralelamente, o BJ agravou o conteúdo sérico e hepático de triglicéridos.Em conjunto, os nossos resultados demonstraram que 24 semanas de dieta HFHS promovem um estado de pré-diabetes em ratos e que a gravidade das alterações metabólicas depende da composição nutricional da dieta controlo, salientando a importância da sua seleção cuidadosa na interpretação dos estudos metabólicos. Para além disso, combinada com uma dieta HFHS, a suplementação com mirtilo pode agravar o metabolismo lipídico num modelo de pré-diabetes em roedor; assim o consumo de mirtilo deverá ser devidamente ponderado nesta fase precoce da doença.

Prediabetes is an intermediate state between normal glucose tolerance and type 2 diabetes (T2DM), with obesity as a major risk factor and associated with many complications such as hepatic steatosis. The progression of hepatic steatosis has been associated with impaired endoplasmic reticulum (ER) stress response and autophagy. The study of prediabetes has been hampered by the scarcity of animal models, most of which are induced by refined diets with a high fat and/or sugar content. These refined diets are usually compared to unrefined control diets ("chow diet”); however, they markedly differ in nutritional composition, especially fiber and phytoestrogen content, which may lead to unanticipated phenotypic differences and erroneous interpretations of results. Although pharmacological interventions are indispensable for the management of T2DM, in prediabetes—a stage where the disease is not yet fully established—lifestyle modifications are instead recommended as first-line interventions. Red fruits, including blueberries, have been associated with beneficial effects in a variety of conditions, including metabolic and cardiovascular diseases, due to their antioxidant, anti-inflammatory, hypolipemic, and insulin sensitizing effects, among others. Considering that insulin resistance, dyslipidemia, oxidative stress and inflammation are the main drivers of prediabetes progression and the development of its complications, blueberry may be a valuable nutraceutical intervention in this early stage of the disease. Nonetheless, the blueberry potential to protect against prediabetes under conditions relevant for human pathogenesis and the molecular mechanisms involved remain largely unexplored. This project aims to: 1) evaluate metabolic, histological and molecular changes in an animal model of prediabetes induced by a high-fat high-sucrose (HFHS) diet compared to two types of control diets, and to 2) identify molecular mechanisms responsible for the putative protective effects of blueberry juice (BJ) supplementation against prediabetes progression. Male Wistar rats were fed for 24 weeks with a prediabetes-inducing refined HFHS diet, a nutrient-matched refined low-fat diet (LFD) and a standard unrefined control diet (CD). A fourth group was fed a HFHS diet supplemented with BJ (HFHS+BJ) starting at week 16, the point when the prediabetic phenotype was achieved. Body weight was monitored throughout the study. After sacrifice, liver and epididymal white (eWAT) and interscapular brown (iBAT) adipose tissue depots were collected and used for histological analysis. Blood was used for biochemical analysis. Thermogenesis, ER stress and autophagy markers were assessed in the iBAT and liver, respectively, by Western blot analysis. HFHS-fed animals presented features of prediabetes, including increased body weight and adiposity, postprandial hyperinsulinemia, glucose intolerance and hepatic steatosis, in parallel with an increase in thermogenic markers UCP-1 and PGC-1α in iBAT. Surprisingly, when compared to CD, LFD-fed animals presented considerable metabolic abnormalities, such as increased eWAT mass, postprandial hyperinsulinemia, glucose intolerance and hepatic steatosis. Impaired ER stress response and autophagy were also observed in both the HFHS and LFD groups, when compared to the CD group. BJ consumption was devoid of effect on body weight gain and adiposity, but attenuated glucose intolerance and decreased the diet-induced alterations in thermogenic, ER stress and autophagic markers. In parallel, BJ aggravated serum and hepatic triglyceride content. Together, our findings demonstrate that 24 weeks of HFHS diet models prediabetes in rats and that the severity of metabolic alterations depends on the nutrient composition of the control diet, highlighting the importance of its careful selection in interpreting metabolic studies. Furthermore, whole blueberry supplementation worsened lipid metabolism in a prediabetic rat model; thus, the blueberry consumption at this early state of the disease should be carefully considered.