Selection of Purification Methods and AAV Serotypes for CNS Transduction

Abstract

Os vetores virais adeno-associados (AAVs) são considerados o veículo mais promissor para a terapia gênica direcionada ao sistema nervoso central (SNC), uma vez que são vírus não patogênicos que infetam células em divisão e células quiescentes, permitindo expressão de longo prazo do transgene e menor citotoxicidade e imunogenicidade em comparação com outros vetores virais. Até ao momento, 13 sorotipos de AAV e mais de 100 variantes foram descobertos, com diferenças no tropismo para tecido/célula, explicadas principalmente pelas interações cápside-recetor. No caso do SNC, os serótipos AAV5 e AAV9 são descritos como os mais promissores, sendo atualmente utilizados em diversos estudos pré-clínicos e clínicos de terapia génica para doenças neurológicas. Além da seleção do serótipo de AAV apropriado, a seleção de um protocolo de purificação de AAV adequado também é fundamental para a transdução tecido/célula, uma vez que as preparações virais podem conter impurezas citotóxicas, que reduzem a eficácia e a segurança da transferência de genes na clínica.Desta forma, o objetivo principal deste projeto foi desenhar e testar um protocolo para a seleção do método de purificação de AAV mais eficaz (gradiente de densidade de iodixanol (IOD) versus gradiente de densidade de cloreto de césio (CsCl)), bem como o serótipo de AAV mais promissor (AAV5 vs AAV9) para transdução celular e do SNC, em condições normais e de doença neurodegenerativa.Na primeira tarefa deste projeto, o nosso objetivo foi avaliar o impacto da purificação de AAV na transdução celular, analisando a infectividade dos serótipos AAV5 e AAV9 em células HEK293T. Os nossos resultados indicaram que o serótipo AAV5 purificado por gradiente de densidade IOD é mais infecioso do que o AAV5 purificado por gradiente de densidade CsCl (91,83% ± 5,01% vs 73,87% ± 1,16%). No caso do AAV9, não foram observadas diferenças significativas entre os métodos de purificação (p>0,05). Além disso, também avaliamos o impacto desses dois métodos de purificação in vivo, analisando a infectividade viral, neuroinflamação e tropismo celular, após injeção bilateral do AAV5 no parênquima estriatal de murganhos wild-type. Da mesma forma, para estudos in vitro, o AAV5 purificado por gradiente de densidade IOD transduziu o estriado de forma mais eficaz do que o AAV5 purificado por gradiente de densidade CsCl (1,32 ± 0,07 vs 0,78 ± 0,05), sem aumentar a neuroinflamação associada ao GFAP (IOD - 0,68 ± 0,05 vs CsCl - 0,67 ± 0,02 e PBS - 0,71 ± 0,09).Após selecionar o método de purificação de AAV mais eficaz para o SNC (ou seja, iodixanol), a segunda parte deste trabalho teve como objetivo selecionar o serótipo de AAV mais promissor (AAV5 e AAV9) no contexto de um distúrbio neurodegenerativo; neste caso, para a Doença de Machado-Joseph (MJD), onde o cerebelo é a principal região afetada. Para esse efeito, os serótipos AAV5 e AAV9, ambos purificados por gradiente de densidade IOD, foram injetados em núcleos profundos do cerebelo (DCN) de murganhos transgénicos YAC MJD. Os nossos resultados mostraram que tanto AAV5 quanto AAV9 transduzem astrócitos e células microgliais em todas as camadas do cerebelo e nos núcleos profundos do cerebelo. As células de Purkinje, “basket” e “stellate” também foram transduzidas por ambos os serótipos de AAV na camada molecular do cerebelo, e neurónios maduros foram transduzidos na camada granular e nos núcleos profundos do cerebelo, sem diferenças visíveis entre os serótipos. É importante ressaltar que nossos dados mostraram que os serótipos AAV5 e AAV9 transduziram 100% das células PARV-19+, nas regiões cerebelares analisadas, demonstrando um grande potencial para a entrega de moléculas terapêuticas às principais células afetadas na MJD (ou seja, células de Purkinje).Em conclusão, o presente estudo permitiu o desenvolvimento e teste de uma pipeline, que constitui um protocolo detalhado para avaliar o impacto de métodos de purificação e/ou serótipos de AAV, fornecendo dados importantes para futuras investigações pré-clínicas e clínicas em doenças direcionadas ao SNC. Em particular, os nossos dados sugerem que os serótipos AAV5 e AAV9, quando purificados por gradiente de densidade IOD, parecem ser adequados para o desenvolvimento de uma terapia génica para MJD, após injeção no parênquima dos DCN.

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are considered the most promising vehicle for gene therapy targeting the central nervous system (CNS), since they are non-pathogenic viruses which can infect effectively both dividing and non-dividing cells, offering a long-term transgene expression and lower cytotoxicity and immunogenicity compared to other viral vectors. Until now, 13 AAV serotypes and over 100 variants were discovered, with differences in tissue/cellular tropism, mainly explained by capsid-receptor interactions. In the case of the CNS, AAV5 and AAV9 serotypes are described as the most promising, being currently used in several pre-clinical and clinical gene therapy studies for neurological diseases. Apart from the selection of the appropriate AAV serotype, the selection of a proper AAV purification protocol is also critical for tissue/cellular transduction, since viral preparations can contain cytotoxic impurities, that reduce the efficacy and safety of clinical gene transfer. In that way, the main goal of this project was to design and test a protocol for the selection of the most effective AAV purification method (Iodixanol (IOD) Density Gradient vs Cesium Chloride (CsCl) Density Gradient), as well as the most promising AAV serotype (AAV5 vs AAV9) for cellular and CNS transduction, in normal and neurodegenerative disease context.In the first task of this project, our purpose was to evaluate the impact of AAV purification in cellular transduction, analysing the infectivity of AAV5 and AAV9 serotypes in HEK293T cells. Our results indicated that the AAV5 serotype purified by IOD density gradient is more infectious than AAV5 purified by CsCl density gradient (91,83% ± 5,01% vs 73,87% ± 1,16%). In the case of AAV9, there were no significant differences between the purification methods (p>0,05). In addition, we also evaluated the impact of these two purification methods in vivo, analysing the viral infectivity, neuroinflammation and cellular tropism, following AAV5 bilateral intra-parenchymal injection in wild-type mouse striata. Similarly, to in vitro studies, AAV5 purified by IOD density gradient transduced the striatum more effectively than AAV5 purified by CsCl density gradient (1,32 ± 0,07 vs 0,78 ± 0,05), without increased GFAP-associated neuroinflammation (IOD - 0,68 ± 0,05 vs CsCl - 0,67 ± 0,02 and PBS - 0,71 ± 0,09).Selected the most effective AAV purification method for the CNS (i.e., iodixanol), in the second part of this work, the purpose was to select the most promising AAV serotype (AAV5 and AAV9) in the context of a neurodegenerative disorder; in this case, for Machado-Joseph Disease (MJD), where the cerebellum is the main affected region. For that, AAV5 and AAV9 serotypes, both purified by IOD density gradient, were injected in deep cerebellar nuclei (DCN) of a YAC MJD transgenic mice. Our results showed that both AAV5 and 9 transduce astrocytes and microglial cells in all layers of the cerebellum and in the deep cerebellar nuclei. Purkinje, basket, and stellate cells were also transduced by both AAV serotypes in the molecular layer of the cerebellum, and mature neurons were transduced in the granular layer and in the deep cerebellar nuclei without visible differences between the serotypes. Importantly, our data showed that both AAV5 and 9 serotypes transduced 100% of PARV-19+ cells in the cerebellar regions analysed, demonstrating a great potential to deliver therapeutic molecules to the main affected cells in MJD (i.e., Purkinje cells). In conclusion, the present study allowed the development and test of a pipeline, which constitutes a detailed protocol for testing the impact of purification methods and/or AAV serotypes, providing important data for future preclinical and clinical investigations in diseases targeting CNS. In particular, our data suggest that both AAV5 and AAV9 serotypes, when purified by IOD density gradient, appear to be suitable for the generation of a gene therapy for MJD upon intraparenchymal injection in DCN.