Elucidação da correlação genótipo-fenótipo em patologias subdiagnosticadas: Hipofibrinogenemia, Disfibrinogenemia e tendência trombótica por níveis elevados de FVIII

Abstract

O estudo molecular de doenças hemorrágicas/trombóticas subdiagnosticadas tem sido um desafio muito complexo onde, muitas vezes, não se consegue obter um diagnóstico final. A evolução de metodologias como o MLPA e o NGS vieram introduzir benefícios substanciais na prática clínica no que concerne ao diagnóstico de doenças hematológicas, especialmente em patologias em que existe uma grande heterogeneidade genética por função pleiotrópica das proteínas envolvidas. Neste estudo pretende-se identificar genótipos associados quer a défices de fibrinogénio quer a eventos trombóticos em idade jovem associados a níveis elevados de FVIII. Recorrendo às mais recentes tecnologias de NGS e MLPA, pretendem-se detetar variantes nos genes, FGA, FGB, FGG e F8 permitindo uma melhoria na análise da correlação genótipo-fenótipo. Estudaram-se dois grupos distintos de doentes: um grupo com patologia hemorrágica e/ou trombótica associado a défice de fibrinogénio e outro grupo com história de trombose e níveis elevados de FVIII. Para o estudo dos genes do fibrinogénio: FGA, FGB e FGG, as amostras de 16 propósitos, e 7 familiares foram analisadas por NGS e MLPA. Os 16 propósitos (8 mulheres, 8 homens), mediana de idade 28 anos (3-58 anos) que apresentavam níveis de fibrinogénio baixo com mediana de 145 mg/dl (intervalo 46-203 mg/dl) ou com suspeita de disfibrinogenémia. Para o gene F8 foram estudados pela técnica de MLPA, 30 indivíduos (7 homens e 23 mulheres), mediana de idade 34.5 anos, com história clínica ou familiar de trombose e níveis elevados de FVIII:176% ± 39.5(176 - 305%). Estudou-se em simultâneo um grupo controlo de 25 indivíduos com as mesmas características, FVIII 186% ± 69 (150 – 469%) mas com idade superior a 50 anos, mediana 62 (51- 89 anos). Através do método de NGS, em 11 dos 16 propósitos (68,75%) foram identificadas variantes que justificavam os fenótipos de hipofibrinogenemia (ligeira, moderada e severa) e disfibrinogenemia. No total, detetaram-se 14 variantes diferentes que apresentavam a seguinte distribuição pelos 3 genes do fibrinogénio: 7 no gene FGA (50%); 4 no FGB (29%) e 3 no FGG (21%). Todas as variantes estavam em heterozigotia sendo a maioria missense: 12 missense (86%), 1 nonsense (7%) e 1 sinónima (7%). De acordo com a literatura, a maioria das variantes patogénicas foram identificadas no gene FGA e domínio E do cluster fibrinogénio, tendo sido também neste domínio que se identificaram fenótipos mais severos.As amostras de 5 propósitos que não apresentaram variantes que justificassem o fenótipo apresentado foram estudadas pela metodologia de MLPA (utilizando-se sondas sintéticas desenhadas e otimizadas neste estudo) para a presença de grandes deleções ou duplicações. No entanto, não foram identificas deleções/duplicações nos genes FGA, FGB e FGG. Os doentes estudados para a duplicação parcial do gene F8, não apresentaram alterações moleculares por MLPA. Contudo, esta estratégia ficou implementada no algoritmo de estudo destas patologias no laboratório. Este estudo permitiu concluir que embora seja necessário estudar um maior número de indivíduos e famílias os estudos moleculares nos genes do fibrinogénio (FGA, FGB e FGG) e F8 permitem identificar subgrupos de doentes que se encontram em maior risco de desenvolver eventos hemorrágicos/trombóticos associados a deficiências de fibrinogénio e a níveis elevados de FVIII e, deste modo, permitir medidas profiláticas e um tratamento mais eficaz.

The molecular study of underdiagnosed haemorrhagic/thrombotic diseases has been a very complex challenge where a final diagnosis is often not achieved. The development of methodologies such as MLPA and NGS have introduced substantial benefits in clinical practice regarding the diagnosis of haematological diseases, especially in pathologies where there is a great genetic heterogeneity due to the pleiotropic function of the proteins involved.This study aims to identify genotypes associated with both fibrinogen deficits and thrombotic events at a young age associated with high levels of FVIII. Using the most recent technologies NGS and MLPA, we intend to detect variants in genes, FGA, FGB, FGG and F8 allowing an improvement in the analysis of the genotype-phenotype correlation.Two distinct groups of patients were studied: one group with haemorrhagic and/or thrombotic pathology associated with fibrinogen deficit and another group with a history of thrombosis and high levels of FVIII.For the study of the fibrinogen genes: FGA, FGB and FGG, the samples of 16 probands, and 7 relatives were analysed by NGS and MLPA. The 16 probands (8 women, 8 men), median age 28 years (3-58 years) who had low fibrinogen levels with a median of 145 mg/dl (range 46-203 mg/dl) or suspected dysfibrinogenemia.For the F8 gene, 30 individuals (7 men and 23 women) were studied by MLPA technique, median age 34.5 years, with clinical or family history of thrombosis and high levels of FVIII:176% ± 39.5(176 - 305%). Simultaneously were studied a control group of 25 individuals with the same characteristics, FVIII 186% ± 69 (150 - 469%) but aged over 50 years, median 62 (51- 89 years). Using the NGS method, in 11 out of 16 probands (68.75%) variants were identified that accounted for the phenotypes of hypofibrinogenemia (mild, moderate and severe) and dysfibrinogenemia. A total of 14 different variants were detected, distributed among the 3 fibrinogen genes as follows: 7 in the FGA gene (50%); 4 in FGB (29%) and 3 in FGG (21%). All variants were heterozygous and most were missense: 12 missense (86%), 1 nonsense (7%) and 1 synonymous (7%). According to the literature, most pathogenic variants were identified in the FGA gene and domain E of the fibrinogen cluster, and it was also in this domain that the most severe phenotypes were identified.The samples of 5 propensities that did not present variants justifying the phenotype presented were studied by MLPA methodology (using synthetic probes designed and optimised in this study) for the presence of large deletions or duplications. However, deletions/duplications in FGA, FGB and FGG genes were not identified. Patients studied for the partial duplication of the F8 gene did not show molecular alterations by MLPA. However, this strategy was implemented in the laboratory's algorithm for the study of these pathologies. This study concluded that although it is necessary to study a larger number of individuals and families, molecular studies in fibrinogen genes (FGA, FGB and FGG) and F8 allow the identification of subgroups of patients who are at greater risk of developing hemorrhagic/thrombotic events associated with fibrinogen deficiencies and high levels of FVIII and, thus, allow prophylactic measures and more effective treatment.