Internship report conducted at The Royal Brompton Hospital, UK

Abstract

Parte IEstabelecido em 2015 e sediado no Royal Brompton Hospital, o Laboratório de Genética Clínica e Genómica (CGGL) oferece testes genéticos de diagnóstico a famílias e indivíduos em risco de doenças cardíacas e respiratórias hereditárias. O laboratório realiza testes para doenças como fibrose cística, aortopatias, vasculopatias, discinesia ciliar primária e hipercolesterolemia familiar, bem como cardiomiopatias e arritmias hereditárias.Durante nove meses realizei o meu estágio no CGGL, tendo ido a oportunidade de acompanhar o trabalho diário realizado num laboratório de genética. Tive a oportunidade de trabalhar com vários softwares de análise de dados, bancos de dados de doentes e com o sistema CGGL LIMS. Além disso, pude participar nas reuniões semanais do laboratório, “jornal club” e reuniões de diagnóstico entre equipas multidisciplinares.Este relatório descreve técnicas moleculares genéticas realizadas no CGGL de modo a obter um diagnóstico genético de doenças cardíacas e respiratórias hereditárias, nomeadamente Sequenciação de Sanger, MLPA, NGS e ddPCR. Adicionalmente, apresentam-se casos de doentes analisados - usando técnicas de modo a ilustrar as suas potenciais aplicações e respetiva análise de resultados.Parte II A discinesia ciliar primária (DCP) é uma doença caracterizada por heterogeneidade fenotípica e alélica e é herdada maioritariamente de forma autossómica recessiva. A maioria das variantes que causam PCD são privadas e o clustering é muito incomum. O diagnóstico da DCP depende de uma combinação de características clínicas, testes ciliares e testes genéticos moleculares conduzidos por sequenciação direcionada. Atualmente, quase um terço dos doentes permanece sem diagnóstico genético. Esta baixa taxa de diagnóstico pode ser explicada pela identificação de apenas uma variante patogénica ou a identificação de variantes de significado incerto.Variantes não codificantes que desempenham um papel significativo na regulação de genes foram sugeridas como responsáveis por uma significativa parte das doenças genéticas raras. Variantes não codificantes penetrantes podem alterar o normal padrão de IIIsplicing de mRNA, criando” cryptic donor/acceptor splice sites”, resultando na inclusão de fragmentos intrónicos não funcionais – “pseudoexons”. Funcionalmente, essas variantes podem resultar em “frameshift” ou a introdução prematura de codões stop e, subsequentemente, levar a “nonsense mediated decay” ou truncamento de proteínas.Este projeto de investigação incluiu 23 casos de doentes previamente identificados heterozigotas para uma única variante patogénica ou provavelmente patogénica. Foram sequenciados genes inteiros dos usando um painel personalizado de NGS contendo as regiões codificantes e não codificantes dos genes relevantes. As variantes identificadas foram analisadas usando ferramentas de bioinformática e in silico “splice predictions”. Mediante a disponibilidade de amostras, a caracterização do transcriptoma foi realizado usando RNA extraído de células epiteliais nasais.Entre os 23 doentes, 4 variantes patogénicas foram identificadas, uma variante sinónima, uma variante intrónica, uma grande deleção genómica do cromossoma 16 e uma deleção do exão 9 no gene CCDC39. Outras 5 variantes potencialmente patogénicas foram identificadas, no entanto, análises moleculares complementares são necessárias para confirmar os resultados.Um diagnóstico genético completo permitirá identificar portadores em membros da família, orientará o planeamento familiar e possibilitará a inclusão do doente em futuros ensaios clínicos relevantes de terapia genica. Além disso, os resultados deste projeto apoiam a relevância e utilidade da inclusão da avaliação de variantes não codificantes no diagnóstico molecular, no futuro.

Part I Established in 2015 and based at The Royal Brompton Hospital, the Clinical Genetics and Genomics Laboratory (CGGL) offers diagnostic genetic testing for families and individuals at risk of inherited cardiac and respiratory disorders. The laboratory conducts testing for disorders such as cystic fibrosis, aorthopathies, vasculopathies, primary ciliary dyskinesia and familial hypercholesterolaemia, as well as inherited cardiomyopathies and arrhythmias.Throughout nine months I conducted my placement at the CGGL, and I got the opportunity to follow the daily task performed at a genetics lab. I had the opportunity to work with several data analysis software’s, patient databases and the CGGL LIMS system. Additionally, I got to assist to lab meetings, journal clubs and diagnostic multidisciplinary team meetings.This report describes genetic molecular techniques performed at the CGGL in order to achieve a genetic diagnosis of inherited cardiac and respiratory disorders such as Sanger Sequencing, MLPA, NGS and ddPCR. Moreover, patient cases analysed using specific techniques have also been added to illustrate the techniques potential applications and their respective analysis of results.Part IIPrimary ciliary dyskinesia is a disorder characterized by phenotypic and allelic heterogeneity and it is primarily inherited in an autosomal recessive fashion. Most of the PCD causing variants are private and clustering is very uncommon. Diagnosis of PCD relies on a combination of clinical features, a series of diagnostic features and molecular genetic testing conducted by targeted sequencing. At present, nearly one-third of the patients remain without a genetic diagnosis, either because results are negative, only one variant has been identified or their results demonstrate variants of unknown significance.Noncoding variants which play a significant role in gene regulation have been suggested to account for a significant burden of causal variants in rare genetic diseases. Penetrant noncoding variants may disrupt the normal pattern of mRNA splicing by creating Vcryptic donor or acceptor sites, which may result in the inclusion of nonfunctional intronic fragments – pseudoexons. Functionally, these variants can result in frameshift or introduction of premature termination codons and subsequently lead to nonsense mediated mRNA decay or protein truncation.This research project investigated 23 cases of patients who had previously been found to be heterozygous for a single pathogenic or likely pathogenic variant. Whole genes were sequenced using a custom next-generation sequencing panel containing the coding and non coding regions of the relevant genes. Variants identified were analysed using bioinformatic and in silico splice predictions tools. Where samples were available, transcript characterization was conducted using RNA extracted from nasal epithelial cells.Out of the 23 patients, 4 disease causing variants were identified, a synonymous variant, an intronic variant, a large genomic deletion of chromosome 16 and a CCDC39 exon 9 deletion. Another 5 potentially disease-causing variants were identified, however further confirmational molecular analysis is required.A complete genetic diagnosis will allow carrier testing in family members, guide family planning and enable the inclusion of the patient in future relevant gene therapy procedures. Furthermore, the results of this project support the relevance and usefulness of the inclusion of the assessment of non-coding variants at the clinical setting, in the future.