NON-INVASIVE PRENATAL SCREENING FOR COMMON ANEUPLOIDIES - IMPLEMENTATION, CONSOLIDATION AND FUTURE

Abstract

Introdução e Objetivos: O diagnóstico pré-natal (DPN) é definido pelos procedimentos, médicos e laboratoriais, que permitam acompanhar o bom desenvolvimento do feto e estabelecer o diagnóstico precoce de eventuais anomalias congénitas. Efetuado em Portugal há mais de 3 décadas, o DPN é baseado em testes invasivos como a amniocentese e a biópsia das vilosidades coriónicas, complementado por testes não invasivos, como a ecografia e rastreio bioquímico, o que permite diagnosticar quase todas as condições com uma causa genética conhecida, com especial destaque para as aneuploidias mais comuns envolvendo os cromossomas 13, 18, 21, X e Y. Com a descoberta do DNA fetal em circulação (cfDNA) no sangue materno, aliada às tecnologias de sequenciação de nova geração (NGS), assistiu-se na última década a uma revolução no DPN, com a introdução do teste pré-natal não invasivo (NIPT). Apesar de se tratar de um teste de rastreio, e não de diagnóstico, o NIPT apresenta alta sensibilidade e alta especificidade na deteção de aneuploidias, com taxas de falsos positivos inferior a 0,1%, razão que levou o American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) a recomendar, em 2020, o seu uso generalizado em todas as gestações. Neste trabalho apresentamos os resultados da implementação de um teste NIPT, através da sequenciação de cfDNA em circulação no sangue materno e utilizando tecnologias de NGS. Serão avaliados os seguintes pontos: 1) critérios de inclusão e de exclusão para a realização do teste; 2) eficácia, rentabilidade, limitações e perspetivas de melhoria; 3) Correlação dos resultados obtidos com parâmetros inerentes á amostragem selecionada; 4) Avaliação do impacto do NIPT na redução de exames invasivos e na redução de perdas fetais.Materiais e Métodos: O trabalho foi dividido em duas partes: Fase 1 – Implementação do NIPT com descrição dos aspetos técnicos e laboratoriais da seleção do teste, procedimento laboratorial, validação, proficiência e implementação. Fase 2 – Consolidação do NIPT, com definição dos critérios de inclusão e exclusão, consentimento informado, logística de processamento, relatórios de análise e aconselhamento genético NIPT. Serão ainda apresentados os resultados do estudo retrospetivo, das primeiras 1130 grávidas que realizaram o teste NIPT entre fevereiro de 2019 e janeiro de 2021, avaliando a taxa de deteção do teste, taxa de resultados inconclusivos, análise da estrutura populacional, tempos de resposta e os fatores significativos que condicionaram a obtenção de resultados conclusivos.Resultados: O teste NIPT foi realizado em 1130 grávidas, tendo sido detetadas e confirmadas 8 trissomias 21 (0,7%) uma trissomia 13 (0,09%), 129 resultados inconclusivos (11,5%) e 992 com ausência/baixo risco de aneuploidia. A análise estatística aos resultados inconclusivos avaliando diferentes parâmetros da amostragem mostrou que são várias os fatores que que podem comprometer a obtenção de resultados com destaque da baixa fração fetal, índice de massa corporal da grávida e qualidade do cfDNA obtido. Para além das trissomias 21 e 13, foram ainda detetadas alterações incidentais no braço curto do cromossoma X e situações de mosaicismo envolvendo os cromossomas sexuais.Conclusão: A implementação do NIPT permitiu oferecer um teste de rastreio a um número maior de grávidas com risco de aneuploidias, diminuindo a necessidade de recurso a testes invasivos. Em termos de eficácia, todas as aneuploidias identificadas foram confirmadas por amniocentese atestando a sua elevada sensibilidade, permitindo resultados fidedignos até a um mínimo de fração fetal de 3%. A sua aplicabilidade em grávidas de IMC elevado revelou-se válida, apenas comprometida em valores superiores a 40. As limitações do teste são a elevada taxa de inconclusivos (7 a 11,5%) e a não aplicabilidade em gestações de gémeos e de dadoras de ovócitos.

Introduction and Objectives: Prenatal diagnosis (PND) defines all medical and laboratory procedures that allow monitoring the normal development of the fetus and establishing the early diagnosis of any congenital anomalies. Performed in Portugal for over three decades, PND includes invasive tests like amniocentesis and chorionic villus sampling and non-invasive tests such as ultrasound and biochemical screening. The invasive non-invasive combination allows the diagnosis of almost all known genetic alterations, including the most common aneuploidies involving chromosomes 13, 18, 21, X, and Y. With the discovery of circulating fetal DNA (cfDNA) in maternal blood, combined with next-generation sequencing (NGS) technologies, the last decade has seen a revolution in PND with the introduction of non-invasive prenatal testing (NIPT). NIPT has high sensitivity and specificity in detecting aneuploidies, with false positive rates of less than 0.1%, a reason that led the American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) to recommend, in 2020, its widespread use in all pregnancies. This work presents the results of implementing a NIPT test by sequencing circulating cfDNA in maternal blood using NGS technologies. The following points will be considered: 1) inclusion and exclusion criteria for carrying out the test; 2) effectiveness, profitability, limitations, and prospects for improvement; 3) Correlation of the results obtained with parameters inherent to the selected sampling; 4) Assessment of the impact of the NIPT in reducing invasive exams and fetal losses.Materials and Methods: The work contains two parts: Phase 1 – Implementation of the NIPT with a description of the technical and laboratory aspects of test selection, laboratory procedure, validation, proficiency, and implementation. Phase 2 – Consolidation of the NIPT, defining the inclusion and exclusion criteria, informed consent, processing logistics, analysis reports, and NIPT genetic counseling. We also present the results of a retrospective study of 1130 pregnant women who underwent the NIPT test between February 2019 and January 2021, evaluating the test detection rate, rate of inconclusive results, analysis of population structure, response times, and the significant factors that conditioned the achievement of conclusive results.Results: The NIPT test revealed eight trisomies of chromosome 21 (0.7%), one trisomy 13 (0.09%), 129 inconclusive results (11.5%), and 992 with absence/low risk of aneuploidy. The Statistical analysis of inconclusive results evaluating different sampling parameters showed that several factors could compromise the achievement of results, meager fetal fraction, pregnant body mass index, and quality of the cfDNA obtained. In addition to trisomies 21 and 13, we also detected unexpected maternal deletions and duplications in the short arm of the X chromosome and mosaicism involving the sex chromosomes.Conclusion: The implementation of the NIPT made it possible to offer a screening test to more pregnant women at risk of aneuploidy, reducing the need for invasive tests. Regarding NIPT performance, all positive results were confirmed by amniocentesis, attesting to their high sensitivity, allowing reliable results up to a minimum fetal fraction of 3%. Its applicability in pregnant women with a high BMI proved valid, only compromised in values above 40. The test's limitations are the high rate of inconclusive results (7 to 11.5%) and its non-applicability in twin and egg donor pregnancies.