Avaliação citogenética e molecular no âmbito do défice cognitivo, perturbação do espetro autista e anomalias congénitas

Abstract

The cytogenetics and genomics techniques allow the characterization of chromosomal rearrangements that may be the underlying cause of cases where there is intellectual disability, congenital anomalies, autism spectrum disorder, or other phenotypic changes. Depending on the aim of the study, choosing the most appropriate technique for the analysis is conditioned by the intrinsic limitations of each one.Genetic studies may be more extensive or directed to certain genomic regions. Conventional cytogenetics allows the constitutive study of chromosomes, detecting chromosomal abnormalities greater than 3-5Mb. On the other hand, aCGH is a high-resolution technique capable of detecting changes with a resolution ~100x higher when compared to the conventional cytogenetics resolution. However, it does not allow the detection of balanced rearrangements, which is one of the limitations of molecular techniques. The resolution of cytogenetics can be increased using molecular cytogenetics, namely FISH, presenting a resolution 50x higher than that of conventional cytogenetics. Nevertheless, it only allows the directed study of certain chromosomal regions. MLPA, QF-PCR, the study by PCR of the CGG trinucleotide repeats for the X-fragile syndrome diagnosis, and NIPT are also selective techniques. MLPA is a semi-quantitative technique that uses specific probes for certain regions of the genome, allowing the evaluation of copy number variations. QF-PCR is based on the amplification of microsatellites and therefore does not allow the assessment of other regions of the genome. Furthermore, it is specific to the STRs of the chromosomes 13, 18, 21, X and Y. The diagnosis of the X-fragile syndrome by PCR consists of the study of the CGG trinucleotide repeats, located at the 5’-UTR region of the FMR1 gene, using specific primers. NIPT is a molecular screening method that uses cell-free fetal DNA in maternal circulation and allows the determination of the fetus’s risk for certain chromosomal abnormalities such as the aneuploidies of the 13, 18 and 21 chromosomes. This is achieved by using the NGS techniques. The use of both cytogenetic and molecular techniques allows to overcome some intrinsic limitations, contributing to a more complete diagnosis and a correct genotype-phenotype correlation. The main aim of this work was to know and master the laboratory technologies applied in pre and postnatal diagnosis and to be able to interpret the results obtained, integrating the concepts acquired throughout the master’s in Clinical Laboratory Genetics. This internship report addresses the different methodologies of conventional and molecular cytogenetics, molecular biology, and genomics in the context of pre and postnatal diagnosis. There is also the characterization of 9 clinical cases using various techniques within the scope of clinical laboratory genetics.

As técnicas da citogenética e da genómica permitem a caracterização de rearranjos cromossómicos que podem estar subjacentes a casos onde existe um défice cognitivo, anomalias congénitas, perturbação do espectro autista ou outras alterações fenotípicas. De acordo com o objetivo do estudo deve-se escolher a técnica mais adequada à análise, tendo em conta as limitações inerentes a cada uma. Os estudos genéticos podem ser mais abrangentes ou então dirigidos para determinadas regiões genómicas. A citogenética convencional permite o estudo constitutivo dos cromossomas, detetando alterações cromossómicas com um tamanho a partir de 3-5Mb. Por outro lado, o aCGH é uma técnica de alta resolução, capaz de detetar alterações com uma resolução ~100x superior à resolução da citogenética convencional. No entanto, não permite a deteção de rearranjos equilibrados, sendo esta uma das limitações das técnicas moleculares. A resolução da citogenética pode ser aumentada recorrendo à citogenética molecular, nomeadamente a FISH, apresentando uma resolução 50x superior à da citogenética convencional. Contudo, esta apenas permite um estudo dirigido para determinadas regiões cromossómicas. O MLPA, o QF-PCR, o estudo das repetições do trinucleótido CGG por PCR para diagnóstico da síndrome do X-frágil e o NIPT também são técnicas dirigidas. O MLPA é uma técnica semi-quantitativa, que utiliza sondas específicas para determinadas regiões do genoma, permitindo avaliar variações no nº de cópias. O QF-PCR baseia-se na amplificação de microssatélites, por isso não permite avaliar outras regiões do genoma. Além disso, é específico para STRs dos cromossomas 13, 18, 21, X e Y. O diagnóstico de X-frágil por PCR consiste no estudo das repetições do trinucleótido CGG, localizadas na região 5’-UTR do gene FMR1, utilizando primers que flanqueiam a região alvo. O NIPT é um método de rastreio molecular que utiliza o DNA fetal livre em circulação materna e permite determinar o risco do feto para determinadas alterações cromossómicas, nomeadamente as aneuploidias dos cromossomas 13, 18 e 21, utilizando as técnicas de NGS.A utilização conjunta das técnicas da citogenética e moleculares permite ultrapassar algumas limitações inerentes a cada uma, contribuindo para um diagnóstico mais completo e uma correta relação genótipo-fenótipo. O principal objetivo deste trabalho foi conhecer e dominar as tecnologias laboratoriais aplicadas no diagnóstico pré e pós-natal e ser capaz de interpretar os resultados obtidos, integrando os conceitos adquiridos ao longo de todo o mestrado. Neste relatório de estágio são abordadas as diferentes metodologias realizadas de citogenética convencional e molecular, biologia molecular e genómica em contexto de diagnóstico pré e pós-natal. No final do relatório são caracterizados 9 casos clínicos recorrendo a diversas técnicas, no âmbito da genética clínica laboratorial.