Caraterização funcional de metiltransferases de tRNA/rRNA da família SpoU em Arabidopsis thaliana (L.) Heyhn

Abstract

Somatic embryogenesis is a micropropagation technique used for plant cloning, but it is also an important system to study embryo development. NEP-TC (Non-Embryogenic Protein from Tamarillo Callus, GenBank accession number JQ766254) is a protein belonging to the SpoU family of tRNA/rRNA methyltransferases and previous studies have suggested that it may be involved in the inhibition of somatic embryogenesis in tamarillo (Solanum betaceum Cav.), since it has been only found in non-embryogenic cells.Functional characterization of NEP-TC is an important step to better understand the role of this protein in somatic embryogenesis induction in tamarillo as well as in plant development. However, the lack of genetic and bioinformatic resources for non-model plants makes this task difficult. As an alternative, in the present study, the plant model Arabidopsis thaliana was used once that phylogenetic studies have revealed the existence of a NETP-TC’s ortholog in Arabidopsis as well as other genes belonging to the SpoU family.Three genes encoding SpoU methyltransferases in Arabidopsis were selected for functi-onal characterization, by comparing different T-DNA insertion lines (obtained from SalkInstitute Genomic Analysis Laboratory) with wild-type Columbia-0 ecotype. Having intoaccount that genetic redundancy is very common in plant genes families and in order tobetter characterize SpoU family in Arabidopsis thaliana, crossings between single mutantlines were performed and a double mutant was obtained.Regarding plant development, germination rate, plant growth rate and root and siliquedevelopment were analyzed. The response of immature seeds to somatic embryogenesisinduction was also evaluated.The obtained results suggest that SpoU methyltransferases in Arabidopsis may play a role in plant development, namely, in plant growth rate and root development, but also in somatic embryogenesis induction. However, the results presented here for somatic embryogenesis induction do not sustain this hypothesis that NEP-TC may act as a somatic embryogenesis inhibitor since the mutant lines revealed a lower rate of explants with somatic embryos formation.More assays need to be done to confirm these results, namely through the obtention of atriple mutant for the genes studied here, but also through the study of tamarillo knock-outlines for NEP-TC, which can be obtained using genome editing techniques such as CRISPR.

A embriogénese somática não é apenas um método de micropropagação, mas também uma ferramenta crucial para o estudo do desenvolvimento embrionário. NEP-TC (Non-Embryogenic Protein from Tamarillo Callus, número de acesso GenBank JQ766254) é uma proteína pertencente à família SpoU de metiltransferases de tRNA/rRNA e estudos prévios sugerem o seu envolvimento na indução de embriogénese somática em tamarilho (Solanum betaceum Cav.), já que apenas se encontra em células não-embriogénicas.A caraterização funcional da NEP-TC é importante para a compreensão do papel desta proteína na indução de embriogénese somática em tamarilho, assim como no desenvolvimento vegetal. Todavia, esta tarefa é dificultada pela falta de ferramentas genéticas e bioinformáticas para plantas não-modelo. Em alternativa, neste trabalho, usou-se a planta modelo Arabidopsis thaliana, já que estudos filogenéticos revelaram a existência de uma proteína ortóloga à NEP-TC em Arabidopsis, assim como outros genes pertencentes à família SpoU.Três genes codificantes de proteínas SpoU em Arabidopsis foram selecionados para caraterização funcional, comparando diferentes linhas com inserções de T-DNA (obtidas através do Salk Institute Genomic Analysis Laboratory) e o ecótipo wild-type Columbia-0. Tendo em conta que a redundância genética é bastante comum dentro das famílias de genes das plantas e, afim de melhor caraterizar a família SpoU em A. thaliana, fizeram-se cruzamentos entre as linhas mutantes simples e foi obtido um duplo mutante.Relativamente ao desenvolvimento vegetal, avaliou-se a taxa de germinação, taxa de desenvolvimento, desenvolvimento radicular e desenvolvimento das síliquas. A resposta desementes imaturas à indução de embriogénese somática foi também avaliada.Os resultados obtidos sugerem um envolvimento da família SpoU de metiltransferases de tRNA/rRNA no desenvolvimento vegetal, particularmente na taxa de desenvolvimento e no desenvolvimento radicular, assim como na resposta à indução de embriogénese somática. No entanto, os resultados aqui apresentados não sustentam a hipótese de que a proteína NEP-TC poderá atuar como inibidora da embriogénese somática, dado que as linhas mutantes revelaram uma menor taxa de explantes com formação de embriões somáticos.Ensaios mais profundos são necessários para confirmar os resultados obtidos, nomeadamente através da obtenção de um triplo mutante para os genes aqui estudados, mas também através do estudo de linhas de tamarilho knock-out para o gene NEP-TC, que poderão ser obtidas através de técnicas de edição genética como a CRISPR.