Novel bacterial taxa isolated from kiwi fruit leaves phenotypic and genomic attributes

Abstract

Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) é o agente causal do cancro bacteriano do kiwi (Actinidia deliciosa e A. chinensis). Esta doença pode causar a morte das plantas, comprometendo a sustentabilidade do setor com perdas económicas significativas nos principais países produtores de kiwis, incluindo Portugal. A Psa foi detetada em Portugal em 2010 com elevada agressividade e uma dispersão muito rápida. Globalmente, a indústria de kiwis está empenhada em desenvolver estratégias de controle da doença para conter a pandemia e minimizar as perdas económicas. Até agora, sem resultados positivos.Neste trabalho pretendeu-se caracterizar quatro putativas novas espécies bacterianas, pertencentes a uma coleção composta por mais de 1000 estirpes previamente isoladas(Pereira, 2017) no âmbito do Grupo Operacional i9Kiwi (www.i9kiwi.pt). Todos os isolados tinham sido preliminarmente agrupados por genotipagem e identificados através da sequenciação parcial do gene 16S rRNA.Neste contexto, foi determinada a sequência total do gene 16S rRNA e realizada uma análise filogenética onde foram identificadas as estirpes filogeneticamente maisrelacionadas com os quatro isolados a caracterizar. Em paralelo, foi determinada a sequência total do genoma dos isolados permitindo determinar os valores de Hibridização Digital DNA-DNA (DDH), Identidade Média dos Nucleótidos (ANI) e similaridade suportando a hipótese de se tratar de novas espécies para a ciência. Por forma a descrever formalmente estas novas espécies foram determinados diversos parâmetros em estudos comparativos com as estirpes filogeneticamente mais próximas, nomeadamente através da caracterização morfológica, fenotípica, quimiotaxonómica, bioquímica e fisiológica. Para cada isolado foi determinado o tamanho celular e morfologia. Nos ensaios de caracterização fenotípica foram determinadas as condições ótimas de crescimento para cada estirpe, nomeadamente meio de cultura, temperatura, pH e salinidade. Os ensaios quimiotaxonómicos foram realizados de forma a determinar,para cada isolado, o perfil de Éster Metílico de Ácido Gordo (FAME), lípidos polares e quinonas respiratórias. Para um dos isolados, foi também analisada a parede celular.Nos ensaios bioquímicos e fisiológicos foram analisadas várias fontes de carbono e a sensibilidade a vários compostos, através de ensaios convencionais de assimilação, degradação e fenotípicos disponíveis em API ® 50CH e API® ZYM. Por fim, foram realizados testes de antagonismo contra Psa e testes de patogenicidade em frutos e folhas de A. deliciosa. Com base nas características fenotípicas, quimiotaxonómicas e filogenéticas das estirpes KWT 1480, KWT 182 e espécies afins, considerou-se que estes isolados representam duas novas espécies do género Acerihabitans. Do mesmo modo, as estirpes KWT 128 e 595 foram consideradas espécies novas do género Skermanella e Frondihabitans, respetivamente.

Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) is the causal agent of the bacterial canker of kiwifruit (Actinidia deliciosa and A. chinensis). This disease can cause the death of plants, compromising the sustainability of the sector with significant economic losses in the main kiwifruit-producing countries, including Portugal. Psa was detected in Portugal in 2010 with high aggressiveness and a very rapid spread. Globally, the kiwifruit industry is engaged in developing disease control strategies to contain the pandemic and minimize economic losses. So far, without positive results.This work aimed to characterize four putative new bacterial species, belonging to a collection composed of over 1000 strains previously isolated (Pereira, 2017) within the scope of the Operational Group i9Kiwi (www.i9kiwi.pt) All isolates had been preliminarily grouped by genotyping and identified through partial sequencing of the gene encoding the 16s rRNA gene by team members.In this framework, the total sequence of the 16S rRNA gene was determined and a phylogenetic analysis was performed where the strains most phylogenetically related to the four isolates to be characterized were identified. In parallel, the total genome sequence of the isolates was determined allowing the determination of the DNA-DNA Digital Hybridization (DDH), Average Nucleotide Identity (ANI) and similarity values supporting the hypothesis that these strains were indeed new species for science. To formally describe these species several parameters were determined in comparative studies with the phylogenetically closest strains, namely morphological, phenotypic, chemotaxonomic, biochemical and physiological characterization. Cell size and morphology were determined for each isolate. In the phenotypic characterization assays, the optimal growth conditions for each strain were defined, namely suitable medium, temperature, pH and salinity. The chemotaxonomic assays were carried out to determine for each isolate the profile of Fatty Acid Methyl Ester (FAME), polar lipids and respiratory quinones. For one of the isolates, the cell wall was also analysed. In biochemical and physiological assays, several carbon sources and the sensitivity to several compounds were analyzed, through conventional, assimilation, degradation and phenotypic assays available in API ® 50CH and API® ZYM. Finally, antagonism tests against Psa and pathogenicity tests on kiwifruits and leaves of A. deliciosa were performed. Based on phenotypic, chemotaxonomic and phylogenetic characteristics of strains KWT 1480, KWT 182 and related species, it was considered that these isolates represent two novel species of the genus Acerihabitans. Similarly, strain KWT 128 and strain 595 were considered novel species of the genus Skermanella and Frondihabitans, respectively.