ANÁLISE DO MICROBIOMA IN VIVO E IN VITRO DE TAMARILHO (SOLANUM BETACEUM CAV.)

Abstract

Solanum betaceum Cav. é vulgarmente conhecida como tamarilho, “tree tomato”, ou “tomate de la Paz”, sendo uma pequena árvore pertencente à família Solanaceae, nativa das regiões andinas da Argentina e Bolívia. Produz frutos comestíveis com interesse económico devido às suas propriedades nutricionais. O tamarilho tem sido amplamente estudado do ponto de vista taxonómico e sistemático. No entanto, poucos estudos foram realizados no que diz respeito aos microrganismos que com ele interagem. O microbioma consiste na população total de microrganismos associada a uma determinada espécie e nas suas interações. Estes microrganismos podem subdividir-se entre os que têm preponderantemente funções associadas à nutrição das plantas, à sua proteção e à bioestimulação. As bactérias endófitas são um exemplo destes microrganismos, vivem dentro de uma planta durante um tempo da sua vida, sem causar danos aparentes ao hospedeiro. Do ponto de vista biotecnológico, estudar um microbioma vegetal pode ser uma ferramenta útil para melhorar o setor agrícola, uma vez que estas bactérias podem conferir vantagens às plantas hospedeiras, promovendo o crescimento, produzindo fito-hormonas, sideróforos e aumentando a resistência a patógenos. Deste modo, adquirir conhecimento sobre espécies bacterianas que estabelecem uma relação simbiótica com as plantas, é o primeiro passo para atingir maiores rendimentos, quando se trata de biotecnologia vegetal. Este projeto teve como objetivo isolar e identificar bactérias endófitas de material vegetal in vivo e in vitro de três árvores de tamarilho (vermelho, amarelo e laranja) presentes no Jardim Botânico da Universidade de Coimbra. Como material vegetal in vivo foram utilizadas folhas, córtex e a medula de segmentos do caule. A medula foi utilizada para a indução de calo, e posterior isolamento de bactérias endófitas. As sementes isoladas dos frutos colhidos das três árvores foram também utilizadas para a obtenção de plântulas de tamarilho germinadas in vitro, e das quais se procedeu ao isolamento de bactérias endófitas O isolamento das bactérias endófitas ocorreu por maceração do material vegetal com tampão PBS. O filtrado foi inoculado em meio ABM2, R2A e LB, com pH 5,5, 7,0, e 8,5, as bactérias cultivadas a 20 °C e 30 °C. 231 isolados de bactérias foram obtidos, 214 provenientes de material in vivo e 17 de material in vitro. As melhores condições de isolamento foram obtidas no meio ABM2 com pH 7, sem diluição, as duas temperaturas testadas apresentaram resultados semelhantes.91 isolados foram submetidos à técnica RAPD-PCR fingerprint para avaliar a sua diversidade genética. Os perfis RAPD dos isolados foram agrupados em 71 clusters. Os isolados referentes aos perfis obtidos foram purificados e sequenciados para obter uma sequência parcial do gene 16S rRNA. Após uma pesquisa na base de dados EzBioCloud os isolados selecionados foram identificados como pertencendo a 22 géneros: Acerihabitans, Aquimarina, Arenivirga, Arthrobacter, Aureimonas, Bacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Cellulomonas, Clavibacter, Curtobacterium, Frigoribacterium, Kineococcus, Kocuria, Marmoricola, Microbacterium, Micrococus, Paracoccus, Rhizobium, Staphylococcus, Sphingobacterium, Serinibacter.Futuramente é relevante continuar o estudo do microbioma do tamarilho, não só para se obter uma identificação completa dos isolados obtidos, mas também para realizar testes bioquímicos de modo a perceber as interações destas bactérias endófitas com o metabolismo da planta.

Solanum betaceum Cav., commonly known as tamarilho, “tree tomato”, or “tomate de la Paz”, is a small tree belonging to the Solanaceae family, and native to the Andean regions of Argentina and Bolivia. It produces edible fruits of economic interest due to their nutritional properties. Tamarillo has been extensively studied from a taxonomic and perspective, however, few studies have been carried out with regard to the microorganisms that are related to it.The microbiome consists of the total population of microorganisms associated with plant and their interactions between them. These microorganisms can be subdivided into those that have predominantly functions associated with plant nutrition, plant protection and biostimulation. Endophytic bacteria are an example of these microorganisms. They live inside a plant for a period or during all its life without causing apparent harm. From a biotechnological point of view, studying a plant microbiome can be a useful tool to improve the agricultural sector, since these bacteria can confer advantages on host plants, promoting growth, producing phytohormones, siderophores and increasing resistance to pathogens. Thus, acquiring knowledge about bacterial species that establish a symbiotic relationship with plants is the first step towards achieving higher yields when it comes to plant biotechnology.This project aimed to isolate and identify endophytic bacteria from plant material in vivo and in vitro from three tamarilho trees (red, yellow and orange) growing in the Botanical Garden of the University of Coimbra. As plant material in vivo, leaves, cortex and pith of stem segments were used. The pith was used for callus induction, and later isolation of endophytic bacteria. The seeds isolated from the fruits harvested from the three trees were also used to obtain in vitro germinated tamarillo seedlings, from which endophytic bacteria were isolated.The extraction of endophytic bacteria occurred by macerating the plant material with PBS buffer. The filtrate was inoculated in ABM2, R2A and LB medium, with pH 5.5, 7.0, and 8.5, the bacteria cultivated at 20 °C and 30 °C. 231 bacterial isolates were obtained, 214 from in vivo material and 17 from in vitro material. The best isolation conditions were obtained in ABM2 medium with pH 7, without dilution, the two temperatures tested showed similar results.91 isolates were submitted to the RAPD-PCR fingerprint technique to assess their genetic diversity. The RAPD profiles of the isolates were grouped into 71 clusters. The isolates referring to the profiles obtained were purified and sequenced to obtain a partial sequence of the 16S rRNA gene. After a search in the EzBioCloud database, the selected isolates were identified as belonging to 22 genera: Acerihabitans, Aquimarina, Arenivirga, Arthrobacter, Aureimonas, Bacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Cellulomonas, Clavibacter, Curtobacterium, Frigoribacterium, Kineococcus, Kocuria, Marmoricola, Microbacterium, Micrococcus, Paracoccus, Rhizobium, Staphylococcus, Sphingobacterium, Serinibacter.In the future, it is relevant to continue the study of the tamarillo microbiome, not only to obtain a complete identification of the isolates obtained, but also to carry out biochemical tests in order to understand how the interactions of these endophytic bacteria with the plant affect plant development and different metabolic pathways.