Elucidating the function of the retropepsin APRc as a moonlighting immune evasion factor of Rickettsia

Abstract

As proteínas “moonlight” exercem múltiplas funções e estão presentes em diferentes organismos. Estas proteínas estão presentes em bactérias comensais e patogénicas, potencialmente contribuindo para a virulência das últimas. O sistema do complemento é fundamental para impedir a infeção e disseminação bacteriana, porém há bactérias que apresentam mecanismos de evasão ao sistema imunitário, escapando aos efeitos bactericidas do soro. Rickettsia é um género de bactérias intracelulares obrigatórias transmitidas por vetores artrópodes, causando doenças ligeiras a potencialmente fatais. Atualmente há uma preocupação crescente com as rickettsioses e o seu impacto na saúde mundial devido à emergência e reemergência destes patógenos, aumento da distribuição geográfica dos seus vetores e ao aumento exponencial da resistência a antibióticos. Deste modo, é crucial encontrar outros alvos para tratar as rickettsioses. Um potencial alvo é a protease aspártica APRc, um homólogo das retropepsinas altamente conservado em Rickettsia. A APRc modula fatores de virulência da superfície de Rickettsia, liga imunoglobulinas do soro, medeia a evasão ao sistema imunitário e resultados preliminares demonstram que a APRc apresenta substratos no soro humano, sugerindo que esta protease possui atividade “moonlight”. Ao longo deste trabalho demonstrámos que a APRc liga a diferentes isoformas de IgG dependente da concentração, ligando preferencialmente a IgG1 e IgG3. Também foi demonstrado que a APRc liga às cadeias leves de anticorpos, ligando preferencialmente à cadeia leve κ e formando complexos APRc-κ. Mais ainda, mostramos que a APRc liga a C3, C4 e C4BP e origina produtos proteolíticos destas proteínas. A presença de IgG aumenta ligeiramente a interação com C4. A degradação proteolítica do C3 não altera a produção da anafilotoxina C3a. Porém, observa-se um grande impacto da APRc na inibição das vias do complemento. Concluindo, com este estudo caracterizámos interações APRc-IgG e confirmámos que a APRc apresenta substratos no soro, contribuindo para o reconhecimento desta protease como uma proteína “moonlight” e como um potencial alvo terapêutico para tratar rickettsioses.

Moonlighting proteins exert more than one function and are present in different organisms, including bacteria. These proteins are present in commensal and in pathogenic bacteria, potentially contributing to the virulence of the latter. The complement system is crucial to stop bacterial infection and spreading, however bacteria display mechanisms of immune evasion, escaping to the bactericidal effects of the serum. Rickettsia is a genus of obligate intracellular bacteria transmitted through arthropod vectors, causing mild to life-threatening diseases such as Mediterranean Spotted Fever and Epidemic Typhus. Currently, there is an increased concern about rickettsioses and their impact on global health because of the emerging and re-emerging of these pathogens, increasing geographical distribution of its vectors, and the exponential increase of antibiotic resistance. Therefore, it is crucial to find other therapeutic targets to treat rickettsial diseases. One potential target is the Aspartic Protease from Rickettsia conorii (APRc), a highly conserved membrane embedded retropepsin-like homologue. APRc modulates Rickettsia surface virulence factors, binds immunoglobulins from the serum, mediates immune evasion and preliminary data indicates that APRc presents substrates in human serum, suggesting that this protease has moonlighting activity. With this work, we demonstrated that APRc binds to different IgG isoforms in a concentration-dependent manner, binding preferentially to IgG1 and IgG3. It was also demonstrated that APRc binds to the antibody light chains, binding preferentially κ light chain and forming APRc-κ complexes. We also validated that APRc binds to and cleaves C3, C4, and C4BP. Moreover, our data suggests that IgG increases APRc-C4 interaction. The proteolytic degradation of C3 does not change the production of the anaphylatoxin C3a. However, it is observed a decrease in the activation of all three complement pathways upon incubation with APRc, confirming a role in immune evasion. In conclusion, with this study we further characterized APRc-IgG interactions and confirmed that APRc targets other serum proteins, contributing to acknowledging this protease as a moonlighting protein and as a potential target to treat rickettsioses.