Development of new imaging and biochemical markers of diabetic complications: Early neurometabolic alterations in obesity and type 2 diabetes mellitus

Abstract

Introdução e objetivos: Diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) é associada a um risco aumentado para o desenvolvimento de complicações neurológicas, as quais são, pelo menos em parte, responsáveis pela elevada mortalidade e baixa qualidade de vida destes pacientes. Desse modo, estas necessitam monitorização e, idealmente, um diagnóstico numa fase inicial através de marcadores bioquímicos e de imagem. Contudo, no que diz respeito a estas complicações, os procedimentos de monitorização são limitados, focando-se maioritariamente em alterações estruturais, as quais estão comumente presentes em fases tardias exclusivamente e são irreversíveis. Há diversos anos que é sabido que a hiperglicemia e a resistência à insulina induzem remodelação sináptica excitatória. No entanto, só recentemente foram também observadas modificações ao nível da sinapse GABAérgica. Consequentemente, estas alterações culminam no desenvolvimento de stress oxidativo. Uma sequência de espetroscopia de ressonância magnética (1H-MRS) foi recentemente desenvolvida denominada “Hadamard Encoding and Reconstruction of MEGA-Edited Spectroscopy” (HERMES), a qual possibilita a deteção cerebral simultânea do ácido gama-aminobutírico (GABA) e glutationa (GSH), medindo, por conseguinte, a sinapse inibitória e stress oxidativo, respetivamente. Este projeto tem como objetivo otimizar o uso da sequência HERMES em modelos animais de obesidade e T2DM, enquanto são identificadas alterações neurometabólicas em fases iniciais destas doenças metabólicas no hipocampo e córtex visual que possam ser futuramente aplicadas na clínica. Materiais e métodos: Três grupos experimentais foram desenhados: (1) grupo controlo composto por ratos Wistar machos exclusivamente alimentados com dieta standard (SD, 10 semanas) (grupo SD); (2) obesidade foi induzida em ratos através da limitação da sua alimentação a dieta gorda (HFD) por 10 semanas (grupo HFD); e (3) ratos obesos foram injetados com uma dose baixa (35 mg/kg, intraperitoneal) de estreptozotocina (STZ) na quarta semana (grupo HFD+STZ). Após as 10 semanas, todos os ratos foram sujeitos a MRS com recurso à sequência HERMES. Este procedimento foi seguido pelo sacrifício destes, momento no qual o hipocampo e córtex visual foram recolhidos e congelados para uso futuro em experiências bioquímicas. Resultados: Recorrendo à sequência HERMES, os níveis de GABA foram obtidos com um coeficiente de variação (CV) de 20.91% e 39.89% no hipocampo e córtex visual, respetivamente. Do mesmo modo, os níveis de GSH apresentaram no hipocampo um CV de 23.82%, enquanto que, no córtex visual, este parâmetro igualou 23.61%. Os níveis de glutamina (Gln), ao contrário do glutamato (Glu), estavam aumentados no córtex visual do grupo HFD+STZ (p = 0.0252), assim como no hipocampo do mesmo grupo (p = 0.0088). Além disso, em contraste ao que é observado no córtex visual, a dieta gorda potenciou a formação de N-acetilaspartilglutamato (NAAG) no hipocampo (p = 0.0365), o que não é observado na mesma região em ratos do grupo HFD+STZ. Similarmente, apenas no hipocampo, um aumento dos níveis de GSH foi observado no grupo HFD (p = 0.0494). Ambas as moléculas partilharam um padrão de variação similar, sugerindo a presença de um mecanismo de compensação mediado pelas duas (r = 0.4652, p = 0.0336). Em contrapartida, este está ausente no córtex visual (r = -0.2111, p = 0.3857). Já no que diz respeito aos níveis de GABA e do recetor de GABA do tipo A (GABAAR), alterações não foram verificadas. Adicionalmente, nenhuma modificação foi observada noutras defesas antioxidantes, nomeadamente na catálase, nem no marcador de viabilidade celular, N-acetilaspartato (NAA).Conclusão: Através das medidas aparentemente exatas obtidas pela sequência HERMES, é possível concluir que, no hipocampo do modelo HFD, a síntese de Glu não foi afetada. Por intermédio do efeito inibitório de NAAG, a libertação de Glu para a fenda sináptica é presumivelmente impedida para a indução da formação de GSH num mecanismo compensatório. Porém, este efeito é perdido no grupo HFD+STZ, evidenciando que os efeitos danosos da T2DM no cérebro se dão previamente ao comprometimento da viabilidade celular. Os metabolitos NAAG e GSH poderão constituir úteis marcadores de alterações neurometabólicas em fases iniciais destas comorbidades.

Introduction and objectives: Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is associated with a great risk of developing neurological comorbidities, which are, at least partly, responsible for the elevated mortality and low life quality of these patients. Therefore, these conditions require monitoring and, ideally, an early diagnosis through biochemical and imaging markers. However, in regard to cerebral complications, the monitoring procedures are limited, mostly focusing on structural alterations which are usually present only at later stages and are irreversible. For several years, it has been showcased that both hyperglycaemia and insulin resistance induce an excitatory synaptic remodelling. However, only recently an equivalent effect was observed in the GABAergic synapse. Furthermore, these alterations have also been related with the onset of oxidative stress. A recent 1H-magnetic resonance spectroscopy (MRS) sequence has been developed entitled Hadamard Encoding and Reconstruction of MEGA-Edited Spectroscopy (HERMES) which enables the simultaneous cerebral assessment of gamma-aminobutyric acid (GABA) and glutathione (GSH), thus inhibitory synapse and oxidative stress, respectively. This project aims to optimize the use of the HERMES sequence on animal models of obesity and type 2 diabetes, while identifying early neurometabolic alterations in the hippocampus and visual cortex that could be clinically applied.Materials and methods: Three experimental groups were designed: (1) Control group of male Wistar rats only fed standard diet (SD, 10 weeks) (SD group); (2) high-fat diet (HFD) induced obese rats for 10 weeks (HFD group); and (3) Obese rats induced to T2DM by an intraperitoneally injected low dose (35 mg/kg) of streptozotocin on week 4 (HFD+STZ group). Upon a 10-week period, all rats were subjected to MRS recurring to the HERMES sequence. This was followed by their sacrifice, moment in which the hippocampus and visual cortex were collected and frozen for later use in biochemical experiments.Results: Resorting to the HERMES sequence, GABA levels were obtained with a coefficient of variance (CV) of 20.91% and 39.89% in the hippocampus and visual cortex, respectively. Likewise, GSH levels presented in the hippocampus a CV of 23.82%; while, in the visual cortex, it equalled 23.61%. Glutamine (Gln), but not glutamate (Glu), levels were elevated in the visual cortex of the HFD+STZ group (p = 0.0252), as well as in the hippocampus of the HFD+STZ group (p = 0.0088). Moreover, unlike what is observed in the visual cortex, HFD potentiated the N-acetylaspartylglutamate (NAAG) formation in the hippocampus (p = 0.0365), which are not observed in HFD+STZ rats. Similarly, in the hippocampus only, an increment of GSH levels was observed in the HFD group (p = 0.0494). Altogether, both these molecules shared a similar variation pattern, suggesting a compensatory mechanism mediated between the two (r = 0.4652, p = 0.0336). The latter was, however, absent in the visual cortex (r = - 0.2111, p = 0.3857). Moreover, GABA levels and GABA type A receptor (GABAAR) were not altered. No changes were observed for other antioxidant defences, including catalase, nor for the marker for cellular viability, N-acetylaspartate (NAA).Conclusion: Through the apparent accurate measurements obtained by the HERMES sequence, we concluded that, in the hippocampus of the HFD model, Glu synthesis was not affected. Through the inhibitory effect of NAAG, Glu release into the synaptic cleft is apparently prevented in order to promote the formation of GSH as a compensatory mechanism. However, this effect is lost in the HFD+STZ model, showing the noxious effects of T2DM in the brain occur even before a compromised cellular viability. The metabolite NAAG and GSH may be valuable early markers of neurometabolic alterations.