UNRAVELLING THE ROLE OF MICRONUTRIENTS IN NATURAL INTRAEPITHELIAL LYMPHOCYTES AND INTESTINAL DEFENCE AT EARLY LIFE

Abstract

De acordo com os dados mais recentes das Nações Unidas e parceiros (UN IGME), globalmente 5.2 milhões de crianças com menos de 5 anos morreram em 2019. Doenças infeciosas, incluindo diarreia, são ainda as principais causas de mortalidade infantil abaixo dos 5 anos. Assim, é necessária uma melhor compreensão da imunofiosiologia intestinal e a sua comunicação com os nutrientes. Os linfócitos intraepiteliais (IEL) intestinais residem e patrulham o epitélio, desempenhando um papel de primeira linha de defesa imunitária no intestino contra patógenos, na manutenção da camada epitelial e controlando o metabolismo. A população de IELs no intestino delgado (SI) é constituída por vários subgrupos de leucócitos, sendo maioritariamente constituída por células T. Entre estas, estão as IELs não convencionais (nIEL), que incluem as células T TCRγδ+ e TCRαβ+, negativas para CD4 e CD8b, e que podem expressar o homodímero CD8αα. No modelo murino, as TCRαβCD8αα nIEL emergem e começam a ampliar a sua população no intestino no após o nascimento onde exibem um fenótipo funcional “ativo mas latente”. Durante o seu desenvolvimento no tipo sofrem seleção self-agonist antigen-based e os seus precursores adquirem recetores de gut-homing, pelo que migram diretamente para o epitélio intestinal durante o início da vida. Estas TCRαβCD8αα nIEL representam umas das primeiras populações de células T com um perfil antigen-experienced a emergir no epitélio após o nascimento, sugerindo um papel de defesa intestinal em idade precoce. Apesar de diversos estudos terem contribuído para o conhecimento atual das TCRαβCD8α nIEL, o seu programa de desenvolvimento mantém-se largamente desconhecido e função sua função específica permanece pouco explorada.A vitamina A é um micronutriente providenciado pela dieta e que desempenha funções imunorreguladoras críticas no sistema imunológico inato e adaptativo. Recentemente o nosso laboratório mostrou que níveis maternais de vitamina A, através do ácido retinóico (RA), seu metabolito ativo, regulam as células linfóides inatas (ILC) e, consequentemente, a formação de órgãos linfóides, incluindo no intestino, estabelecendo a imunidade da descendência a longo prazo. Estes dados sugerem que sinais provenientes da vitamina A poderão controlar estas innate-like TCRαβCD8αα nIELs e potencialmente a sua função na defesa imunitária no intestino.Neste estudo, investigámos a função de TCRαβCD8αα nIELs reguladas por RA na defesa intestinal. Para isso, averiguamos em primeiro lugar a capacidade de defesa intestinal contra patogénicos intestinais em murganhos com células T deficientes em sinalização por RA, incluindo TCRαβCD8αα nIELs. Investigámos ainda a função específica das TCRαβCD8αα nIELs reguladas por RA transferindo seletivamente esta população a partir de murganhos wild-type (WT) para murganhos com células T deficientes em sinalização por RA e murganhos imunodeficientes. Com vista a explorar se esta população de IEL tem como função a nível molecular de produção de moléculas efetoras foram ainda avaliadas as produções de moléculas chave na defesa imunitária após infeção com Eimeria vermiformisOs resultados indicam que murganhos deficientes em sinalização por RA estão mais suscetíveis a infeções por Eimeria vermiformis. Estes murganhos apresentaram uma dificuldade maior em desenvolver o seu peso e apresentam maior carga parasítica quando infetados por Eimeria vermiformis. Em murganhos WT, foi ainda possível verificar a expressão de granzima B (GzmB) por parte das TCRαβCD8αα nIELs enquanto em murganhos CD4CreRARAHom, para além de um número significativamente menor de TCRαβCD8αα nIELs, os linfócitos presentes não expressavam GzmB. A análise de murganhos NSG transferidos com TCRαβCD8αα nIELs mostrou que estas células aparentam ter, ainda que ténue, um efeito protetor no epitélio intestinal uma vez que apresentam cargas parasíticas ligeiramente menores comparativamente ao grupo veículo. Os dados relativos à expressão de AW112010 também demonstrou que TCRαβCD8αα nIELs provenientes de murganhos CD4CreRARAHom mostram uma regulação negativa do gene deste Long non-coding RNA (LncRNA).Este estudo representa um melhor entendimento da barreira mucosa intestinal permitindo um aprofundamento do conhecimento dos mecanismos de defesa intestinal em idade precoce bem como é mais um passo em frente para em última instância descobrir novas terapias que permitam minimizar os números de mortalidade infantil a nível global.

According to the latest data from the United Nations and partners (UN IGME), globally 5.2 million children under the age of 5 died in 2019. Infectious diseases, including diarrhea, are still the leading causes of under-5 mortality. Thus, a better understanding of intestinal immunophysiology and its communication with nutrients is needed. Intestinal intraepithelial lymphocytes (IEL) reside in and patrol the epithelium. They are the first line of enteric immune defence. The population of IELs in the small intestine (SI) is constituted by several subsets. Among these, are the unconventional IELs (nIEL), which include TCRγδ+ and TCRαβ+ T cells, negative for CD4 and CD8β, and which can express the CD8α homodimer. During their development, the TCRαβCD8αα nIEL precursors (IELp) acquire gut-homing receptors and migrate directly to the intestinal epithelium during early life. These nIEL TCRαβCD8αα represent one of the first populations of T cells with an antigen-experienced profile to emerge in the epithelium after birth, suggesting an intestinal defence role at an early age. Although recent advances in current knowledge of the TCRαβCD8α nIEL, its developmental program remains largely unknown, and its specific function remains little explored. Vitamin A is a dietary micronutrient that plays critical immunoregulatory functions in the innate and adaptive immune system. Recently, our laboratory showed that maternal levels of vitamin A, through retinoic acid (RA), its active metabolite, regulate innate lymphoid cells (ILC) and, consequently, the formation of lymphoid organs, including the intestine, establishing immunity from long-term offspring. These data suggest that signals from vitamin A could control these innate-like TCRαβCD8αα nIELs and potentially their role in the immune defence in the gut.Here, we investigated the role of RA-regulated TCRαβCD8αα nIELs in intestinal defence. For this, we first investigated the ability of intestinal defence against intestinal pathogens in mice with RA-deficient T cells, including TCRαβCD8αα nIELs. We further investigated the specific function of RA-regulated TCRαβCD8αα nIELs by selectively transferring this population from wild-type (WT) mice to RA-deficient and immunodeficient mice. To explore whether this IEL population plays a role at the molecular level in the production of effector molecules, the production of key molecules in the immune defence after infection with Eimeria vermiformis was also evaluated. The results show that RA-deficient mice are more susceptible to Eimeria vermiformis infections since these mice had shown more difficulty in developing their weight and had a higher parasite load when infected with Eimeria vermiformis in early life. In WT mice, it was also possible to verify the expression of granzyme B (GzmB) on TCRαβCD8αα nIELs while in CD4CreRARAHom mice, in addition to a significantly lower number of TCRαβCD8αα nIELs, the lymphocytes present did not express GzmB. The analysis of NSG mice transferred with TCRαβCD8αα nIELs showed that these cells appear to have, even if without significance, a protective effect on the intestinal epithelium as they have slightly lower parasite loads compared to the vehicle group. Data concerning the expression of AW112010 also demonstrated that TCRαβCD8αα nIELs from CD4CreRARAHom mice show a downregulation of the gene of this Long non-coding RNA (LncRNA).This study a better understanding of the intestinal barrier allows a deeper understanding of intestinal mechanisms is a step forward as well as a further step forward for the last attempt at child protection planned to minimize mortality figures at a global level.