Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana - Aplicações de Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana e Bactérias e Vírus

Abstract

As infeções por microrganismos multirresistentes (MDR) são um dos grandes desafios para os sistemas de saúde e para as empresas farmacêuticas e prevê-se que este problema aumente, consideravelmente, ao longo das próximas décadas. A Organização Mundial da Saúde (OMS) informou que podemos retornar à época onde infeções comuns e ferimentos leves podem matar, causando consequências desastrosas ao longo da vida. Existe, assim, uma necessidade urgente de uma nova classe de antibióticos ou de um novo tratamento que seja eficaz contra as espécies multirresistentes. As infeções podem ser causadas por diferentes tipos de microrganismos, como bactérias, vírus, fungos ou parasitas. Do ponto de vista biológico, as bactérias podem ser dividas em dois grupos, as gram-positivas ou as gram-negativas. Estes dois grupos possuem diferenças nas suas paredes celulares. Uma grande parte dos estudos de terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) são realizados com bactérias na forma planctónica, contudo as bactérias persistem em ecossistemas de biofilmes e raramente em culturas de uma única espécie. Nos biofilmes, os microrganismos são notavelmente menos suscetíveis aos antimicrobianos em comparação com os seus homólogos planctónicos. Para além das infeções causadas por células bacterianas, os vírus são muito abundantes e podem ser encontrados em uma ampla variedade de formas. Eles têm a capacidade de infetar células eucarióticas ou procarióticas para forçá-las a produzir milhares de cópias do vírus infetante. A terapia fotodinâmica antimicrobiana surgiu, deste modo, como uma proposta promissora para o tratamento de infeções localizadas, especialmente infeções cutâneas ou mucosas. A terapia fotodinâmica (PDT) consiste na administração de um medicamento ou de um corante não tóxico, designado como fotossensibilizador (PS, do inglês photosensitizer). Após um determinado intervalo de tempo, a lesão é iluminada com luz visível, com um comprimento de onda específico absorvido pelo PS administrado. O PS após absorver a luz fica num estado eletrónico excitado e reage com moléculas de oxigénio levando à formação de espécies reativas de oxigénio (ROS). O objetivo deste trabalho consistiu em avaliar o potencial de uma clorina catiónica como possível fotossensibilizador em terapia fotodinâmica antimicrobiana. Primeiramente, foi avaliada a capacidade deste composto em reduzir a carga viral, em células HEK que expressam o recetor ACE2 e que se encontram infetadas com partículas lentivirais pseudotipadas, garantindo a viabilidade celular destas células. Numa das experiências, o fotossensibilizador foi ativado juntamente com o vírus e só depois foi adicionado às células. Nesta experiência, verificou-se que ocorria uma redução de cerca de 50 % da carga viral em condições que eram mantidas a viabilidade celular. Numa segunda condição, as células foram incubadas com o vírus e com o PS e só depois ocorreu a irradiação diretamente nas células. Nas condições de realização deste ensaio, a viabilidade celular após tratamento foi muito baixa e é necessário a realização de um novo ensaio de forma a garantir condições em que haja viabilidade celular elevada. Numa segunda parte do trabalho, o objetivo consistiu em avaliar a atividade do fotossensibilizador para iluminação de bactérias gram-positivas e gram-negativas na forma planctónica e na forma de biofilmes, garantindo sempre, condições de viabilidade celular para as células hospedeiras. Os resultados obtidos mostram que com apenas 0,3 µM de fotossensibilizador, incubado por 1 hora e com apenas 5 J/cm2 já é possível obter uma redução de 3 log de CFU/ml nas bactérias S. aureus, enquanto que com as E. coli são precisos 0,4 µM de fotossensibilizador para se verifica esta redução.Nos biofilmes, a redução de pelo menos 3 log de CFU/ml só foi atingida usando uma concentração de 50 µM com 1h de incubação e 4 J/cm2. Por fim, com 10 µM de PS foi realizado um estudo para verificar se o tempo de incubação tinha influência e verificamos que ao aumentar o tempo de incubação do fotossensibilizador em contacto com o biofilme antes da irradiação, a inativação era maior.

Infections by multidrug-resistant microorganisms (MDR) are a major challenge for health systems and pharmaceutical companies, and this problem can be expected to increase considerably over the coming decades. The World Health Organization (WHO) has reported that we can return to a time when common infections and infectious diseases can kill. There is thus an urgent need for a new class of antibiotics or a new treatment that is effective against multidrug-resistant species. Infections can be sensitive to different types of microorganisms such as bacteria, viruses, fungi, or parasites.From a biological point of view, bacteria can be divided into two groups: gram-positive or gram-negative. These two cell groups have differences in their walls. A large part of the studies done on antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is carried out with bacteria in planktonic form, but persistent bacteria form biofilm ecosystems and rarely of a single species. In biofilms, bacteria are notably less accessible to antimicrobials compared to their planktonic counterparts.In addition to very flexible bacterial cell infections, viruses are plentiful and can be found in a variety of forms. They all have the common ability to infect eukaryotic or prokaryotic cells and force them to produce copies of infective viruses.Antimicrobial photodynamic therapy has emerged as a promising proposal for the treatment of localized infections, especially skin infections or infections of mucous membranes. Photodynamic therapy (PDT) consists of the administration of a drug, which is a non-toxic dye called a photosensitizer (PS). After a certain time, the lesion is illuminated with visible light, with a specific wavelength absorbed by the administered PS. The PS after absorbing light is in an excited oxygen state and reacts with oxygen molecules, forming reactive oxygen species (ROS).The objective of this work is to evaluate the potential of a cationic chlorin as a possible photosensitizer in antimicrobial photodynamic therapy. First, the ability of this compound to reduce viral load was evaluated in HEK cells that express the ACE2 receptor and that are infected with pseudo typed lentiviral particles, guaranteeing the cell viability of these cells. In one of the experiments, the photosensitizer was activated together with the virus and only then was it added to the cells. In this experiment, a reduction of about 50% in viral load was found to occur under conditions that maintained cell viability. In a second condition, the cells were incubated with the virus and with the PS, and the irradiation occurred directly in the cells. Cell viability was low in this assay, and it is necessary to carry out new experiments to guarantee conditions in which cell viability is high.In a second part of the work, the objective was to evaluate the activity of the photosensitizer towards gram-positive and gram-negative bacteria in planktonic and biofilm form, always ensuring cell viability conditions for the human cells. The results show that it is possible to obtain a reduction of 3 log CFU/ml in S. aureus bacteria with only 0.3 µM of photosensitizer, incubated for 1 hour, and with only 5 J/cm2, whereas in E. coli, 0.4 µM of photosensitizer is required to verify this reduction.In biofilms, a reduction of at least 3 log CFU/ml was only achieved using a concentration of 50 µM with 1 h of incubation and 4 J/cm2. Finally, with 10 µM of PS, a study was carried out to verify if the incubation time had an influence, and we found that by increasing the incubation time of the photosensitizer in contact with the biofilm before irradiation, the inactivation was greater.