Genetic analysis of axon guidance mechanisms during ambryonic development of Drosophila melanogaster using DNA microarrays

Abstract

O cruzamento axonal da linha média durante o desenvolvimento do Sistema Nervoso Central do embrião da Drosophila melanogaster envolve a participação de diversos receptores e ligandos. Muitas moléculas chave no direccionamento axonal foram identificadas em invertebrados e vertebrados, mas o papel da transcrição no controlo dos mecanismos de direccionamento axonal tem sido pouco estudado. Nesta dissertação efectuámos uma análise genómica global da regulação da transcrição em embriões de Drosophila, através da tecnologia de microarrays. Para o efeito usámos mutantes e transgénicos de direccionamento axonal, que se encontram bem caracterizados. Na tecnologia de microarrays da Affymetrix, algoritmos de Medidas de Expressão (ME) combinam os valores de várias sondas – correspondentes ao mesmo gene – num único valor. Neste trabalho avaliámos o desempenho de cinco MEs – MAS.5.0, dChip, RMA, PDNN e GCRMA – combinando análise estatística global com informação biol ógica conhecida. O uso de um estudo biológico – por oposição a um estudo de spike-in – permitiu avaliar as MEs em condições reais de preparação laboratorial. Os nossos resultados indicaram que RMA e PDNN são as ME mais equilibradas. MAS.5.0 é a ME menos fiável. dChip revela lacunas em algumas tarefas, enquanto que GCRMA apresenta falhas para valores de intensidade muito baixos. As experiências de microarrays produzem vastas quantidades de dados, sendo necessário algoritmos computacionais para analisar globalmente os resultados. Neste trabalho adaptámos o algoritmo de clustering HOPACH (Hierarchical Ordered Partitioning and Collapsing Hybrid), que combina as vantagens de algoritmos de partição e hierárquicos. A nossa adaptação de HOPACH identificou grupos pequenos e homogéneos, produzindo simultaneamente clusters grandes, de genes expressos de forma não diferencial. O nosso método elimina o passo de filtro, que reduz o número de genes interessantes. Caracterizámos os clusters resultantes de HOPACH relativamente à sua relevância no direccionamento axonal através de dois vocabulários controlados: Gene Ontology (GO) e as anotações anatómicas do Atlas of Pattern of Gene Expression (APoGE). Sugerimos vários genes candidatos para futuras experiências e provámos que a combinação de clustering com vocabulários controlados resultante da literatura e de padrões de expressão in situ é uma abordagem eficaz no estudo de redes de transcrição. O Cluster 49001 contém um número significativo de genes expressos em hemócitos – células sanguíneas da Drosophila. Observámos através de expressão de RNA que nos mutantes de slit e nos mutantes duplos de slit e robo a migração dos hemócitos não ocorre normalmente; surpreendentemente o duplo mutante para robo e robo2 – os receptores de slit – não apresenta o mesmo fenótipo para os hemócitos, o que sugere que a migração dos hemócitos poderá ocorrer através do envolvimento de slit, mas sem o envolvimento dos habituais receptores de slit. Há um conjunto de clusters enriquecido em ciclinas celulares, o que nos levou a examinar os padrões de expressão de RNA e proteína em mutantes e transgénicos de direccionamento axonal. Os resultados obtidos mostram que a sobre-expressão de robo é acompanhada por um aumento de RNA e proteína de várias ciclinas celulares; também observámos que as células que expressam ciclinas celulares estão anormalmente localizadas nos embriões de slit e robo12, encontrando-se afastadas da linha média. Estas duas observações sugerem um envolvimento, até ao momento desconhecido, das ciclinas celulares no direccionamento axonal. O resultado desta dissertação indica que a regulação da expressão genética tem um papel relevante no direccionamento axonal. Também encontrámos uma ligação entre direccionamento axonal e migração dos hemócitos, um resultado que está de acordo com resultados publicados recentemente [57] que indicam que moléculas de direccionamento axonal foram cooptadas durante a vascularização em vertebrados. Outra conclusão do nosso estudo aponta para a importância das ciclinas celulares no contexto do direccionamento axonal. Estes resultados ajudam a compreender melhor os mecanismos de regulação do direccionamento axonal in vivo.

The process of midline crossing in the development of the Central Nervous System (CNS) in the Drosophila melanogaster embryo is orchestrated by a number of receptors and ligands. Many key axon guidance molecules have been identified in both invertebrates and vertebrates but the role of transcription in the control of axon guidance remains largely unknown. We conducted a microarray genome wide analysis of the transcriptional regulation of axon guidance in Drosophila embryos, using wild type and a number of well-characterized axon guidance mutants and transgenics. We used the Affymetrix technology, whose first step uses Measure of Expression (ME) algorithms to combine the values of several probes – corresponding to one gene – into one single value. We established a series of tasks to evaluate five of the MEs – MAS.5.0, dChip, RMA, PDNN and GCRMA. Each task was based on a known truth and combined global statistical analysis with specific biological information. Using an actual biological study – in opposition to spike-in studies – evaluates the algorithms in situations of real laboratory work. Our results showed that RMA and PDNN are the most balanced MEs. MAS.5.0 is the most unreliable ME, dChip performs poorly in some tasks and GCRMA has problems dealing with low intensity probes. Microarray experiments produce large amounts of data hence computational algorithms are appropriate to globally analyze the results. In this work we adapted and further developed HOPACH (Hierarchical Ordered Partitioning and Collapsing Hybrid), a clustering algorithm which combines the advantages of partitioning and hierarchical algorithms. Using the adapted HOPACH, we identified small homogeneous groups of genes, while simultaneously producing big clusters of non-differentially expressed genes. Our method circumvents the filtering step, which discards interesting genes. We systematically characterized the HOPACH gene clusters with respect to their relevance in axon guidance using two complementary controlled vocabularies: Gene Ontology (GO) and anatomical annotations of the Atlas of Pattern of Gene Expression (APoGE). We suggest several genes as candidates for future experiments and prove that combining clustering with both controlled vocabulary generated from the literature and in situ expression patterns is a powerful approach to the study of transcriptional networks. Cluster 49001 contains a significant number of genes expressed in hemocytes – the Drosophila blood cells. We observed through RNA expression analysis that in the slit mutant and in the double mutant for slit and robo, hemocytes’ migration does not proceed normally; surprisingly, the double mutant for robo and robo2 – the known receptors for slit – does not show the same hemocyte’s phenotype. Hemocytes’ migration could proceed with slit’s involvement, but without slit’s usual receptors. Cell cyclin genes are enriched in a group of clusters, which led us to examine the RNA and protein patterns of cell cyclins in axon guidance mutants and transgenics. Our results showed that the overexpression of robo is accompanied by an increase in RNA and protein levels of several cell cyclins. We also observed that cell cyclin expressing cells are abnormally located in slit and in the double robo12 mutants; the cell cyclin expressing cells are visible away from the midline. Both these observations suggest a previously unknown involvement of cell cyclins in axon guidance. Our work indicated that regulation of gene expression does play a role in the process of axon guidance. We found a strong link between axon guidance and hemocyte migration, a result that agrees with mounting evidence that axon guidance molecules are co-opted in vertebrate vascularization [57]. Cell cyclin activity in the context of axon guidance is also suggested from the data of our study. These results provide important insights into the regulation of axon guidance in vivo.