Mechanisms of neurodegeneration in transgenic models of Huntington's disease

Abstract

Huntington’s disease (HD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by an expanded CAG repeat in the IT15 gene, which encodes for huntingtin. The disease is classically characterized by accumulation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions, a progressive degeneration of neurons in the striatum and the cerebral cortex, which leads to progressive motor and cognitive deterioration, and inevitably death. Since the discovery of the mutation responsible for HD, several transgenic rodent models have been generated. The most widely studied are the R6 lines that express exon 1 of the IT15 gene with 115 (R6/1) or 145 (R6/2) CAG repeats. The work presented in this thesis further characterizes these transgenic HD rodent models (particularly the R6 mice) and describes, for the first time, a number of novel histological and functional changes in HD. The first part of this thesis evaluates changes in neurotransmitter systems, at the level of glutamate receptor stimulation (Chapter 2) and dopamine (DA) release (Chapter 3). More precisely, the work presented in Chapter 2 demonstrates that, unlike R6 mice that are known to be resistant to excitotoxic insults, a newly generated HD transgenic rat (which expresses 22% of the IT15 gene with 51 CAG repeats) is not resistant to this damage. These results, together with previous research, suggest that the response of transgenic HD rodent models to excitotoxicity is dependent on the length of the transgene expressed. On the other hand, Chapter 3 describes an impairment in the release of DA in R6/1 mice, as determined by in vivo microdialysis upon membrane depolarization-induced exocytosis and DA transporter-mediated efflux. In support of this result, a reduction in whole striatal DA levels and basal levels of DA metabolites were also observed. These results suggest a dysfunction of the dopaminergic nigrostriatal pathway in HD. The second part of this thesis explores the involvement of nonstriatal brain regions, namely the lateral hypothalamus (Chapter 4) and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus (Chapters 5 and 6), in the neuropathology of the R6/2 HD mouse. Chapter 4 describes, for the first time, loss of specific neuronal populations in the lateral hypothalamus of R6/2 mice. Two major neuronal populations were affected: orexin-containing neurons (which regulate the sleep/wakefulness cycle) and melanin-concentrating hormone-containing neurons (which play a role in maintaining energy homeostasis). Importantly, the progressive loss of orexin neurons was accompanied by the development of narcoleptic-like symptoms in R6/2 mice, which closely resemble the deficits reported in orexin knockout mice by other researchers. In conjunction with the loss of these neurons we also observed decreased levels of orexin in the cerebrospinal fluid of end-stage R6/2 mice. Interestingly, we also found loss of orexin neurons in samples of the lateral hypothalamus of HD patients. Overall, these results clearly implicate the lateral hypothalamus in the pathology of HD. Finally, Chapters 5 and 6 describe, for the first time, a dysfunction in yet another nonstriatal brain region, the DG of the hippocampus, in R6/2 mice. The DG constitutes one of the regions in the adult mammalian brain where neurogenesis (i.e., generation of new neurons) occurs. R6/2 mice show a progressive decrease in the number of proliferating cells and neurons in the DG when compared to wild-type littermate controls. Moreover, this decrease can be detected as early as 2 weeks of age, when the R6/2 mice do not show any clear behavioral symptoms. Finally, treating the R6/2 mice with asialoerythropoietin (an erythropoietin analogue) did not reverse the decreased rate of neurogenesis nor had any effect on the neuropathology or the development of motor symptoms. Overall, the results presented in this thesis provide new evidence that corroborates the implication of excitotoxicity and dopaminergic dysfunction in the HD striatum. It also demonstrates pathological changes and morphological dysfunction in nonstriatal structures, such as the lateral hypothalamus and the DG of the hippocmapus. Moreover, this data further contributes to our understanding of the transgenic rodent models used in HD research by expanding our knowledge of their neuropathology. We speculate that this work may be instrumental in the design and screening of new therapies to treat this devastating neurodegenerative disorder.

A doença de Huntington (HD, do inglês ‘Huntington’s disease’) é uma doença neurodegenerativa causada pela expansão de repetições do trinucleotídeo CAG no gene IT15 que codifica a proteína huntingtina. Esta doença é classicamente caracterizada pela formação de inclusões nucleares de huntingtina em células neuronais e pela progressiva degenerescência dos neurónios do estriado e do córtex cerebral. Clinicamente, a HD manifesta-se pela deterioração progressiva das capacidades motoras e cognitivas, resultando na morte do paciente. Desde a descoberta da mutação responsável pela HD, vários modelos transgénicos têm vindo a ser gerados em rato e ratinho, entre os quais se destacam as linhas R6 que expressam o exon 1 do gene IT15 com 115 (linha R6/1) ou 145 (linha R6/2) repetições do trinucleotídeo CAG. O trabalho apresentado nesta tese caracteriza alguns destes modelos transgénicos (em particular os ratinhos R6) e descreve, pela primeira vez, alterações morfológicas e funcionais que poderão contribuir para a patologia da HD. Na primeira parte desta tese são avaliadas as alterações nos sistemas de neurotransmissão, em particular a activação de receptores de glutamato (Capítulo 2) e a libertação de dopamina (DA) (Capítulo 3). Deste modo, o trabalho apresentado no Capítulo 2 demonstra que o modelo transgénico para a HD que foi recentemente gerado em rato (e que expressa 22% do gene IT15 com 51 repetições do trinucleotídeo CAG) não apresenta alterações na susceptibilidade dos neurónios do estriado a lesões excitotóxicas. Estes resultados, juntamente com estudos anteriores, sugerem que a resposta dos vários modelos transgénicos para a HD a insultos excitotóxicos é dependente do tamanho do transgene. Por outro lado, no Capítulo 3 são apresentadas novas evidências que suportam uma desregulação na libertação de DA em ratinhos R6/1. A libertação deste neurotransmissor foi detectada por microdiálise in vivo após exocitose induzida por despolarização da membrana plasmática e após indução da libertação de DA através do seu transportador membranar. Para além disso, um decréscimo dos níveis totais de DA no estriado e dos níveis basais dos metabolitos de DA foram observados em ratinhos R6/1. Estes resultados confirmam o envolvimento de uma disfunção da via dopaminérgica nigro-estriatal na patologia da HD. A segunda parte desta tese explora o envolvimento de algumas regiões cerebrais não estriatais, o hipotálamo lateral (Capítulo 4) e o giro dentado (DG, do inglês ‘dentate gyrus’) do hipocampo (Capítulos 5 e 6), na neuropatologia do ratinho R6/2. O Capítulo 4 descreve, pela primeira vez, a perda de populações neuronais no hipotálamo lateral de ratinhos R6/2. Os neurónios afectados contêm orexina (um peptídeo que regula o ciclo diurno/nocturno) ou a hormona concentradora da melanina, que desempenha um papel importante na manutenção da homeostase energética. A perda progressiva dos neurónios que contêm orexina é acompanhada pelo desenvolvimento de sintomas do tipo narcoléptico nos ratinhos R6/2, semelhantes aos sintomas descritos em ratinhos que não expressam o gene da orexina. Para além disso, os níveis deste peptídeo no líquido cefalorraquidiano de ratinhos R6/2 também se encontram reduzidos, e a perda de neurónios que contêm orexina também foi detectada em cérebros de doentes com HD. Estes resultados reforçam a importância do hipotálamo lateral na patologia da HD. Finalmente, os Capítulos 5 e 6 descrevem, pela primeira vez, a disfunção de outra região cerebral não estriatal, o DG do hipocampo, no ratinho R6/2. O DG constitui uma das regiões no cérebro adulto de mamíferos onde ocorre a formação de novos neurónios, um processo designado por neurogénese. Os ratinhos R6/2 apresentam um decréscimo progressivo no número de células proliferativas e de novos neurónios nesta região cerebral, quando comparados com ratinhos controlo da mesma idade. Para além disso, este decréscimo pode ser detectado às duas semanas de idade, uma altura em que os ratinhos transgénicos ainda não apresentam quaisquer sintomas. Por fim, o tratamento de ratinhos R6/2 com asialo-eritropoietina (um análogo da eritropoietina) não teve qualquer efeito na redução da proliferação celular observada no hipocampo destes animais, bem como na neuropatologia e no desenvolvimento dos sintomas motores. Conjuntamente, os resultados apresentados nesta tese corroboram o envolvimento da excitotoxicidade e da disfunção dopaminérgica na HD, e demonstram, ao nível morfológico e funcional, o envolvimento de estruturas cerebrais não estriatais na patologia da HD. Para além disso, estes resultados contribuem para uma melhor caracterização dos modelos transgénicos mais usados na investigação da HD e descrevem novos aspectos da sua neuropatologia, possibilitando o desenvolvimento de novas terapias para esta doença neurodegenerativa.