Mecanismo redox do antineoplásico Rituximab e da sua interação in vitro com o dsDNA

Abstract

O Rituximab (RTX) é um anticorpo monoclonal quimérico direcionado especificamente para o receptor CD20 existente à superfície dos linfócitos B, introduzido no mercado para o tratamento de linfomas non-Hodgkin. O presente trabalho teve como objetivo investigar o comportamento electroquímico do RTX à superfície do eléctrodo de carbono vítreo (GCE) bem como a sua interação com o ácido desoxirribonucleico (DNA). Os resultados obtidos usando um filme de RTX para electrólitos de suporte no intervalo 3 < pH < 9, mostraram o aparecimento de um pico correspondente à oxidação da tirosina para todos os valores de pH e de um pico correspondente à oxidação da metionina, a pH = 3 e 4. Sendo uma proteína estruturalmente complexa, foi necessário submeter o RTX a uma desnaturação química de modo a tornar possível uma caracterização mais completa da proteína no GCE. Assim, biossensores electroquímicos de RTX foram incubados a diferentes tempos numa solução fosfato 0,1 M a pH = 7, com os agentes redutores ditiotreitol (DTT) e tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) e com o desnaturante dodecil sulfato de sódio (SDS). Comparando com o controlo, verificou-se que o SDS e o TCEP expõe um maior número de resíduos de tirosina à superfície do eléctrodo, enquanto que o DTT desestabilizou mais extensamente a cadeia polipeptídica, permitindo a deteção da oxidação da histidina e da tirosina e dos dois primeiros passos de oxidação do triptofano. Após incubação do biossensor dupla hélice DNA (dsDNA) com o RTX, verificou-se a existência de uma forte interação entre ambos com condensação da estrutura helical do DNA, depurinação, dano oxidativo e interação preferencial do RTX com o resíduo de adenosina. O processo revelou ser reversível e dinamicamente intemporal. O estudo do comportamento electroquímico dos agentes redutores utilizados para auxiliar na caracterização electroquímica do RTX, foi realizado com o GCE e os seus mecanismos de oxidação propostos. O DTT sofre oxidação no grupo tiol, enquanto que o TCEP sofre oxidação na fosfina central.

Rituximab (RTX) is a chimeric monoclonal antibody that targets the CD20 surface receptor on B-lymphocytes, for the treatment of non-Hodgkin´s lymphoma. The aim of this work was to investigate the electrochemical behaviour of RTX at the glassy carbon electrode (GCE) surface and its interaction with DNA. The results using a RTX layer for electrolyte solutions between 3 < pH < 9, showed an oxidation peak for tyrosine for all pH range and an oxidation peak for methionine at pH = 3 and 4. RTX was denatured due to its complex structure with denaturant and reductants. Thus, RTX biosensors were incubated at different time periods in pH = 7.0 0.1 M phosphate buffer, with dithiothreitol (DTT) and tris(2- carboxiethyl)phosphine (TCEP) as reductants and with sodium dodecyl sulphate (SDS) as denaturant. Comparing with the control, in the presence of SDS and TCEP it was possible to expose more tyrosine residues at GCE surface, while DTT was able to destabilize extensively the polypeptidic chain, allowing the detection of histidine and tyrosine oxidation and the first two steps of tryptophan oxidation. After the incubation of DNA double helix biosensor (dsDNA) with RTX, it was observed a strong interaction between them with DNA condensation, oxidative damage, depurination and a preferential interaction between DNA deoxyadenosine and RTX. The process was shown to be reversible and dynamically timeless. The study of the electrochemical behaviour of reductant agents used to auxiliate on the RTX electrochemical characterization, was performed on GCE and their oxidation mechanisms were proposed. The DTT oxidation step occurs at the sulfhydryl group while TCEP occurs at the central phosphine.