Cultura in vitro e análise molecular de Olea europaea L. cultivar Galega Vulgar

Abstract

A oliveira (Olea europaea L.) é uma das 35 espécies do género Olea, não se conhecendo de forma inequívoca o seu local de origem. Esta espécie encontra-se muito difundida na zona Mediterrânica, sendo aqui que se situam 98% das oliveiras cultivadas, representando portanto uma enorme importância económica. São conhecidos cerca de 2000 cultivares, embora alguns sejam os mesmos, mas sob denominação diferente. Em território nacional foram descritos 22 deles, destacando-se o cultivar Galega vulgar pela vasta área que ocupa, cerca de 80% da área total de olival, e pelas características que o tornam tão importante, tais como a resistência à salinidade, ao stresse hídrico e a algumas doenças como a provocada pelo fungo Verticillium. Para além disso, produz um dos azeites existentes no mercado mais apreciado pelos consumidores devido ao seu sabor característico, aroma, baixa acidez e grande estabilidade oxidativa. Tendo em conta a importância deste cultivar e o reduzido número de estudos nele realizados, optou-se neste trabalho pela análise do potencial embriogénico desta espécie, quer em termos de embriogénese somática e polínica. Para além disso, tentouse a manutenção de alguns clones por micropropagação e analisou-se também a variabilidade de alguns cultivares comparativamente à Galega Vulgar. Relativamente à micropropagação através da proliferação de meristemas axilares, foi testado o meio base OM com a substituição do manitol por sacarose. Testou-se ainda o efeito de alguns reguladores de crescimento tendo-se verificado que a inclusão de ácido indolbutírico (IBA) e de benziladenina (BA) não permitiu uma propagação eficaz. Para além disso, verificou-se uma forma de contaminação endógena que limitou severamente os ensaios. Em relação à embriogénese somática, a sua indução foi estudada em embriões zigóticos maduros (EZ) provenientes de três clones de Galega vulgar (1061, 2052, 502), colocados em cultura intactos ou seccionados em três partes (radicular, meristemática e cotiledonar) em diferentes meios. Foi observada a formação de estruturas embrionárias, embora com aspecto anómalo, nos meios contendo 2 ou 5 mg/l de ácido naftaleno-acético (NAA), 0,5 mg/l de dimetil-alil-amino-purina (2IP) e 8% de sacarose, após cerca de dois meses de cultura. A maior percentagem de indução foi conseguida no meio OM com 2 mg/l de NAA com embriões zigóticos intactos do clone 502, embora não se tenham verificado diferenças significativas na percentagem de indução de embriogénese somática entre as diferentes situações. Foram utilizados também embriões zigóticos em estados mais precoces de desenvolvimento, tendo a resposta sido muito mais reduzida. Na indução de embriogénese polínica, foram cultivadas anteras com 2 ou 3 mm, não tendo havido, em situação alguma, a formação de embriões, apenas calo. No entanto, por esmagamento de anteras de 2 mm em cultura, foi possível observar grãos de pólen multinucleados nas anteras cultivadas em meios com BA combinado com NAA ou ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). A análise de variabilidade foi feita recorrendo a marcadores RAPD, utilizando primers, descritos anteriormente como discriminativos para Galega, que demonstraram um polimorfismo de 95%. Os sete cultivares estudados foram agrupados em três grupos, de acordo com o índice de similaridade, com uma boa correlação entre eles (r=0.81132). Assim, a Galega Grada de Évora parece ser próxima da Cobrançosa e Cordovil e as Galega Grada Normal, Grada de Serpa e a Galega X podem não ser mesmo Galegas, aparecendo separadas da Galega vulgar. Os resultados aqui obtidos devem ser complementados com análises mais aprofundadas para optimizar os protocolos desenvolvidos para os poder confirmar.

The olive tree (Olea europaea L.) is one of the 35 species included in the genus Olea, for which the precise zone of origin was not yet determined. This species is widespread around the Mediterranean area, where 98% of the cultivated olive trees are present, assuming a relevant economic impact. About 2000 cultivars of Olea europaea are known, although some represent the same genotype with a different name. In our country are known at less 22 cultivars, but the cultivar Galega vulgar due to the large area in which is cultured (80% of the orchards) is particularly important. The characteristics that make this cultivar so interesting are its resistance to salinity, water stress and some diseases such as that caused by the fungus Verticillium. Moreover, its oil is much appreciated by consumers, because of their characteristic flavor, aroma, low acidity and high oxidative stability. Taking into account the importance of this cultivar and the small number of studies carried on it, it was decided to analyze the embryogenic potential of this species, both in terms of somatic and pollen embryogenesis. In addition, it was attempted to maintain some clones by micropropagation and to analyze the variability of some cultivars compared to Galega Vulgar. Micropropagation assays through the proliferation of axillary buds, on the OM medium supplemented with sucrose instead of mannitol with sucrose were performed. The effect of some growth regulators such asindolebutyric acid (IBA) and benzyladenine (BA) was also evaluated. The results showed that neither mannitol or these growth regulators were able to improve the micropropagation rates. Besides, a severe endogenous contamination appeared on these conditions hence impairing shoot proliferation. Somatic embryogenesis, was induced in mature and immature zygotic embryos (EZ) from three Galega vulgar clones (A, B and C), placed in culture intact or divided in three sections (root, meristem and cotyledons) in different culture media. Embryonic structures of abnormal phenotypes were produced on media supplemented with 2 or 5 mg/l naphthalene acetic acid (NAA), 0.5 mg/l dimethyl-allylamino purine (2iP) and 8% sucrose, after about two months of culture. The highest percentage of induction was achieved in OM medium plus 2 mg/l NAA on intact zygotic embryos of clone 502, although no significant differences were found among genotypes or culture media. Pollen embryogenesis, was tested in anthers at different developmental stages (2 and 3 mm). Pollen embryos were never formed but callus formation occurred in most of the cultures. Cytological analyses of cultured anthers showed the presence of some multinucleate pollen grains in anthers (2 mm) cultured in medium with BA combined with NAA or 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). The analyses of genetic diversity were performed using RAPDs with primers previously used in Galega. The seven cultivars tested were separated into three groups according to the similarity index, with a good correlation between them (r = 0.81132). Thus, the Galega Grada Évora seems closer Cobrançosa and Cordovil and Galega Grada Normal, Grada Serpa and Galega X may not be related with Galega, appearing separated from Galega vulgar. More work needs to be performed to strongly sustain the results here presented.