Propriedades de Subpopulações de Espermatozóides Humanos: Sexo e Bioenergética

Abstract

Os gâmetas masculinos humanos são caracterizados por uma grande heterogeneidade. De facto, apenas alguns dos espermatozóides presentes no ejaculado aparentam ser verdadeiramente funcionais. Durante este estudo procurámos olhar para esta heterogeneidade e encontrar diferentes propriedades nas quais estas subpopulações diferissem. Os critérios considerados para a obtenção destas subpopulações foram o conteúdo em ácido desoxirribonucleico (ADN) das células em estudo (presença de um cromossoma X ou Y), o seu potencial de membrana mitocondrial (PMM) e a sua mobilidade. De forma a identificar e separar estas células recorremos à técnica de citometria de fluxo acoplada a cell sorting (FACS) e à técnica de swim-up. No que respeita à separação de espermatozóides feita com base no ADN, foram utilizadas três sondas distintas (DRAQ5™, DyeCycle™ Violeta e Hoechst33342) com vista na obtenção da maior eficiência de separação possível. Contudo, nenhuma das sondas usadas conduziu a um enriquecimento aceitável em espermatozóides portadores de um cromossoma X (máximo de 67%) ou Y (máximo de 59%). Por esta razão, não prosseguimos para a caracterização destas subpopulações. Os espermatozóides humanos requerem adenosina trifosfato (ATP) para o seu correcto funcionamento. Portanto, outro objectivo deste estudo foi determinar os níveis de ATP das diferentes subpopulações separadas, quer com base no potencial de membrana mitocondrial (FACS), quer com base na mobilidade das células (Swim-up). Esta determinação foi feita com recurso ao ensaio de bioluminescência da Luciferase, cujo resultados mostram não haver diferenças entre as subpopulações separadas desta forma. Conclusivamente, as sondas de ADN testadas não são apropriadas para a separação de espermatozóides portadores de um cromossoma X ou Y nas condições utilizadas. Em adição, as subpopulações de espermatozóides separadas com base na mobilidade e PMM apresentam quantidades de ATP semelhantes, sugerindo que o conteúdo em ATP destas células não é exclusivamente dependente da actividade mitocondrial.

Human male gametes are characterized by a large heterogeneity. In fact, only a few of the sperm cells of a population seem to be truly functional. During this study we have looked into his heterogeneity and tried to find some properties in which different sperm subpopulations differ. Our criteria for separating these subpopulations were DNA content (X and Y bearing chromosomes), mitochondrial membrane potential (MMP) and motility. To identify and separate the cells we have used flow cytometry activated cell sorting (FACS) and swim-up. In what concerns the separation based on DNA content, we used three different probes (DRAQ5™, Vybrant® DyeCycle™ Violet and Hoechst 33342) in order to obtain the highest efficacy of separation. However, none of them leaded to an acceptable enrichment in either X- (67%) or Y- (59%) bearing sperm. For this reason we did not continue to characterize these subpopulations. It is known that human sperm cells require adenosine triphosphate (ATP) for their proper function. Therefore, another aim in this study was to determine the levels of ATP in different subpopulations separated by their mitochondrial membrane potential (FACS) and by their motility (Swim-up). This determination was made using Luciferase bioluminescence assay, and the results show that there are no differences between the subpopulations separated this way. In conclusion, the DNA probes tested are not appropriate for X/Y sperm selection in the used conditions. Additionally, sperm subpopulations separated by both motility and MMP have undistinguishable amounts of ATP suggesting that sperm ATP content is not exclusively dependent on mitochondrial activity.