Isolation, characterization and differentiation of stem cells from the apical papilla: potential uses in regenerative medicine

Abstract

Todos os anos, milhões de dentes são preservados recorrendo ao tratamento endodôntico convencional. No entanto, esta abordagem resulta num dente não vital com risco acrescido de fratura e infeção. Um tratamento ideal consistiria numa abordagem regenerativa onde os tecidos necróticos são removidos e substituídos por tecido pulpares vitais, melhorando o prognóstico do dente intervencionado. Esta estratégia promoveria a regeneração do complexo dentino-pulpar e a continuação do desenvolvimento radicular. A Associação Americana de Endodontia estabelece três pontos-chave para a realização de tratamentos regenerativos: (i) deve ser utilizada uma fonte celular fiável, com capacidade de diferenciação em odontoblastos; (ii) as células devem ser suportadas por uma matriz que promova o crescimento e a diferenciação celular; e (iii) devem estar presentes moléculas sinalizadoras, como fatores de crescimento ou outros compostos bioativos, que estimulem a proliferação celular e orientem a diferenciação celular. A identificação e caracterização das células estaminais dentárias tem promovido a sua utilização em novos tratamentos clínicos. Lesões graves, tais como cáries profundas ou trauma, podem levar à necrose da polpa dentária. Nestes casos, a sobrevivência da zona celular da papila apical é de extrema importância para os processos regenerativos. A capacidade das células estaminais da papila apical (SCAPs) migrarem da papila apical para o interior do canal, com o objetivo de substituir as células/tecidos danificados, continua a ser um aspeto de interesse. Contudo, para além do recrutamento in situ destas células em tratamentos endodônticos através de “cell homing”, existem vários estudos que visam a aplicação direta de células estaminais dentárias, cultivadas ex vivo, na regeneração de tecidos. O recrutamento de células estaminais através da colheita de dentes autólogos/não autólogos produz uma população muito significativa de células que apresentam vários marcadores estaminais e elevado potencial de diferenciação. Além disso, a aplicação local de uma população de células estaminais enriquecida pode ser uma técnica relevante em endodontia clínica, mas também em aplicações na medicina regenerativa em geral. Dentro do grupo das células estaminais dentárias, selecionámos as SCAPs como uma população de interesse cujo potencial em regeneração endodôntica se encontra pouco estudado. Estas células apresentam como principais vantagens: (i) constituírem uma população celular abundante, (ii) frequentemente descartada durante a extração de terceiros molares, (iii) apresentam potencial de diferenciação em diferentes tipos de células, (iv) o custo de cultura e manutenção é reduzido e (v) podem ser preservadas criogenicamente. Assim, colocámos a hipótese de que as SCAPs poderiam ser utilizadas na regeneração da polpa dentária in vivo, e que a presença de materiais bioativos não interferiria com a diferenciação celular e a formação de tecidos. Para responder a esta questão, estabelecemos dois objetivos principais. Primeiro, procurámos determinar se as SCAPs isoladas a partir de terceiros molares humanos, seriam afetadas in vitro pelos biomateriais - ProRoot MTA e Biodentine. Para tal, avaliámos a viabilidade, proliferação e migração destas células, quando cultivadas na presença de diferentes eluatos destes cimentos. Em segundo lugar, pretendemos gerar um modelo de regeneração da polpa dentária utilizando um modelo in vivo. Investigámos os efeitos a longo prazo (4 meses) na regeneração de tecidos das SCAPs/plasma rico em plaquetas, na presença de Biodentine e de ProRoot MTA, aplicados num modelo organotípico de fragmento radicular, subcutaneamente implantado num rato imunodeprimido. Concluímos, que o Biodentine e o ProRoot MTA são bem tolerados pelas SCAPs. In vivo, descobrimos que a presença destas células leva à formação de novo tecido dentário e que os diferentes materiais promovem trajetórias distintas na formação de tecido duro. Além disso, pudemos observar a presença de uma vasta variedade de células nos implantes, como células tipo-odontoblasto, células tipo-cementócito, bem como a formação de pontes dentinárias. Este trabalho destaca o potencial desta população celular em tratamentos regenerativos endodônticos, proporcionando uma primeira comparação do comportamento das SCAPs in vivo na presença de dois biomateriais diferentes, comummente utilizados na clínica.

Millions of teeth are saved each year by root canal therapy. However, endodontic treatment results in a non-vital tooth at increased risk for fracture and infection. An ideal form of endodontic therapy would consist of regenerative strategies, in which diseased or necrotic pulp tissues are removed and replaced with healthy tissue in order to revitalize and strengthen the intervened tooth. This would promote the regeneration of the dentin-pulp complex and promote normal root development. To achieve this, three key aspects have been underlined by the American Association of Endodontists: (i) a reliable cell source capable of differentiating into odontoblasts should be employed; (ii) these cells should be supported by an appropriate scaffold to promote cell growth and differentiation; and (iii) signaling molecules, both growth factors and other bioactive compounds, should be present to aid cellular proliferation and direct cellular differentiation. The identification and characterization of stem cells from dental tissues, has directed the use of these cells in new clinical treatments. Severe injuries such as deep caries or trauma, can lead to dental pulp necrosis. The survival of the cell rich-zone of the apical papilla is of the extreme importance for the endodontic regenerative processes in these cases. The ability of stem cells from the apical papilla (SCAPs) to migrate to the canal area from the apical papilla and replace damaged cells/tissues remains an area of interest. However, beyond the in situ recruitment of these cells in endodontic treatments using cell homing, there are now several studies aimed at applying dental stem cells, grown ex vivo, for direct tissue regeneration. Recruitment of stem cells via harvesting from autologous/non-autologous teeth yields a very significant population, with several stemness markers and wide differentiation potential. Moreover, the local application of enriched stem cells population can be a relevant and disruptive methodology not only for clinical endodontics but also for applications in regenerative medicine in general. From the broader group of dental stem cells, we selected SCAPs as a potentially attractive population that is still understudied for direct endodontic regeneration. Among their advantages, SCAPs are: (i) an abundant cell population, (ii) often discarded when individuals remove third molars, (iii) display potential to differentiate into different cell types (iv) are inexpensive to grow and maintain in culture, and (v) may be cryogenically preserved. Taken together, we hypothesize that SCAPs could be used for dental pulp regeneration in vivo, and that the presence of common bioactive materials would not interfere with cellular differentiation and tissue formation. To address this, we tackled two main goals. First, we aimed to determine if SCAPs isolated from human third molars, would be affected, in vitro, by the common endodontic biomaterials – ProRoot MTA and Biodentine -. For this we assessed the viability, proliferation and migration of these cells, when incubated in the presence of eluates from these cements. Second, we wanted to generate an in vivo model of dental pulp regeneration. For this, we investigate the long-term effects (4 months) on SCAPs/platelet-rich plasma-driven tissue regeneration in the presence of Biodentine and ProRoot MTA, placed in an organotypic root fragment and implanted in athymic nude rat. We concluded that Biodentine and ProRoot MTA are generally well tolerated by SCAPs. In vivo, we found that these cells induced de novo dental tissue formation and that different biomaterials promoted different trajectories in hard tissue formation. Additionally, we could find a wide array of cells present in the implants, from odontoblast-like to cementocyte-like cells, as well as the formation of dentinal bridges. This work highlights the potential use of this cell population for endodontic regenerative treatments and provides a first comparison on the in vivo behavior of SCAPs in the presence of two commonly used biomaterials.