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https://hdl.handle.net/10316/99193
Title: | Scale for mapping the brain: the role of stargazin in regulating dendritic spine morphology | Authors: | Costa, Joana de Freitas Fresco Rodrigues | Orientador: | Cortes, Luísa Carvalho, Ana Luísa |
Keywords: | stargazina; CACNG2; ScaleA2; ScaleS; morfologia de espículas; stargazin; CACNG2; ScaleA2; ScaleS; spine morphology | Issue Date: | Jul-2016 | Place of publication or event: | Coimbra | Abstract: | Esquizofrenia e Deficiência intelectual são duas doenças que hoje em dia afetam entre 1 e 3% da população mundial, respetivamente. Estudos recentes demonstram a relevância de mutações em genes que codificam proteínas sinápticas na patogénese de doenças neuropsiquiátricas (Volk et al., 2015). Um desses genes é o CACNG2 que codifica a stargazina, uma proteína de 37 kDa, transmembranar, auxiliar dos recetores AMPA e que se localiza na pós-sinapse. A stargazina influencia o tráfico sináptico e propriedades biofísicas dos AMPAR (Chen et al., 2000; Letts et al., 1998; Roberts et al., 2011). Para além disto, a stargazina também afeta a complexidade da arborização dendrítica (resultados não publicados) e medeia a plasticidade homeostática (Louros et al., 2014). Dado o papel sináptico da stargazina e também a sua interação com proteínas do citoesqueleto, colocámos a hipótese de a stargazina poder ter um papel na modulação da morfologia das espículas dendríticas. Para testar esta possibilidade, silenciámos a expressão da stargazina em neurónios de fatias organotípicas de hipocampo usando RNA de interferência tendo como alvo a stargazina. Analisámos a morfologia das espículas em neurónios de hipocampo transfetados e observámos que o silenciamento da stargazina afeta o balanço entre espículas imaturas e maduras, levando a um aumento de cerca de 65% na ocorrência de estruturas do tipo filopodia, ou seja, precursores de espículas. De acordo com o nosso conhecimento, este trabalho fornece a primeira evidência da influência da stargazina na morfologia das espículas em neurónios de hipocampo. Também gerámos e caraterizámos um vetor lentiviral capaz de expressar mCherry e stargazina wild-type ou variantes de stargazina associadas a doença. Este vetor lentiviral ajudar-nos-á, no futuro, no estudo da influência de mutantes de stargazina associados a doença na morfologia das espículas e na arborização dendrítica.
Finalmente, otimizámos e implementámos os métodos ScaleA2 e ScaleS, protocolos de clearing de tecido que nos ajudarão a adquirir imagens de microscopia em profundidade em tecidos biológicos. Com este tipo de protocolos poderemos usar secções espessas de cérebro para análise da morfologia neuronal. Com estes protocolos conseguimos obter sinal fluorescente endógeno em camadas mais profundas em cérebros de ratinho. Para isto usámos microscopia confocal para obter images de z-stack que variaram entre 200-500 μm para o ScaleA2 e cerca de 250 μm para ScaleS. Por outro lado, usando o microscópio multifotão conseguimos obter 1 mm de espessura de imagens de z-stack. Acreditamos que este tipo de metodologia será extremamente importante em futuras investigações no estudo do papel da stargazina e variantes de stargazina associadas a doença. Schizophrenia and Intellectual Disability are two disorders that affect 1 and 3% of the worldwide population, respectively. Recent genetic studies point the relevance of mutations in genes coding for synaptic proteins in the pathogenesis of neuropsychiatric disorders (Volk et al., 2015). One of those genes is CACNG2, which encodes for stargazin, a 37 kD AMPA receptor (AMPAR), transmembrane, auxiliary protein that localizes postsynaptically and binds physically to AMPAR. Stargazin influences AMPAR synaptic traffic and biophysical properties (Chen et al., 2000; Letts et al., 1998; Roberts et al., 2011). Additionally, stargazin affects neuronal dendritic arborization complexity (unpublished data) and mediates homeostatic plasticity (Louros et al., 2014). Given the synaptic roles of stargazin, and also its interaction with cytoskeletal proteins, we hypothesized that stargazin may have a role in modulating the morphology of dendritic spines, the sites that house the postsynaptic element of excitatory synapses. In this project, we tested this hypothesis. In order to do so, we silenced stargazin expression in neurons in organotypic hippocampal slices using interference RNA to target stargazin. We analyzed spine morphology in transfected hippocampal neurons and found that the deletion of stargazin affects the balance between immature and mature spines, leading to a ~65% increase in the occurrence of filopodia-type structures, which are spine precursors, at the expense of thin and mature spines. To our knowledge, this work provides the first evidence for stargazin influence on spine morphology in hippocampal neurons. We also generated and characterized a lentiviral vector expressing mCherry and wild-type or disease-associated variants of stargazin. This lentiviral vector will help us study, in the future, the influence of stargazin-disease related mutants in spine morphology and dendritic arborization. Finally, we have optimized and implemented ScaleA2 and ScaleS methods, tissue clearing protocols that allow in depth imaging of biological tissue. With this type of protocol, we can use thick brain sections to image neuronal morphology. With these protocols we could obtain endogenous fluorescence signal in deep layers of the mouse brain. In order to do so, we used confocal microscopy to obtain 200-500 μm for ScaleA2 and ~250 μm for ScaleS thick image stacks. Multiphoton microscopy allowed us to obtain 1 mm thick image stacks. We believe that this type of methodology will be extremely important for the study of the role of stargazin and its disease-associated variants in the brain. |
Description: | Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. | URI: | https://hdl.handle.net/10316/99193 | Rights: | embargoedAccess |
Appears in Collections: | FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado |
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