Potentiation of Dendritic Cell Phenotypic and Functional Characteristics for Application in Next-Generation Cancer Immunotherapy

Abstract

The field of cancer immunotherapy is growing at a fast pace, with new developments in this field leading to changes in cancer therapy. Dendritic cells (DCs) are immune cells with a key role at the interface of innate and adaptive immunity. DCs application in immunotherapy has been scrutinised and settled as highly desirable and full of translational and clinical potential, with around 400 clinical trials focused on anti-tumor DC vaccines. Notwithstanding the good safety profile of DC immunotherapy, the rate of success in inducing clear therapeutic outcomes is inconstant. In parallel with the growing knowledge of cancer biology, DC-based approaches must be optimized given that most of the protocols were already established twenty years ago. The production of clinical grade monocyte-derived DCs (mo-DCs) is the most frequent approach for antitumor vaccines production. Typically, mo-DCs are generated from culturing monocytes with variable concentrations of granulocyte-macrophage colony- stimulating factor (GM-CSF) and interleukin (IL)-4. However, mo-DCs do not possess the ideal functional and phenotypical characteristics required for the induction of a robust anti- tumor immune response. Hence, there is a large space for improvement of protocols and a clear need for the establishment of clinical standard operating procedures (CSOPs). Cancer stem cells (CSCs) are a recently identified small cell population present in the tumor, resistant to radio/chemotherapy and known to be responsible for disease recurrence. Therefore, developing a DC vaccine targeting CSC may represent a promising approach in cancer therapy. In this study, we aimed to (1) contribute to the standardization of CSOPs, (2) to target and eradicate CSCs by developing a DC-based immunotherapy targeting these cells, and to (3) develop novel cocktail combinations for tailoring DC differentiation into superior subsets with enhanced immunogenic properties in relation to mo-DCs. First, we performed an in-depth analysis on the impact of good manufacturing practice (GMP) media on the production of clinical-grade DCs. DCs generated in different media presented different phenotypical and functional capacities. Just by changing the nutritive support, we were able to shift DCs profile from immunogenic to a more tolerogenic outline. Importantly, DCs produced in GMP media presented highly different phenotypic and functional features from the ones generated in Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)/pre-clinical medium. These results highlight the gap between pre-clinical data and their translation into a clinical setting. Second, we loaded DCs with CSC lysates and compared the phenotypic profile, functionality and the capacity of these DCs to prime cytotoxic T-lymphocyte cells (CTLs) in relation to classical DCs, loaded with total tumor cell lysates. Our preliminary results demonstrated that DCs loaded with pancreatic CSC lysate were able to trigger T cells to an enhanced and specific elimination of CSCs. These results indicate that our strategy may be an effective approach to eliminate CSCs, a core tumor cell population. Third, from two high-throughput screenings comprising 168 initial combinations, we reached two novel cocktails for DC differentiation that may be alternatives to standard mo- DCs protocols, attaining DC differentiation into subsets with enhanced immunostimulatory properties. DCs differentiated in the presence of these cocktails, C91 and C102, presented a superior maturation profile by expressing higher levels of the co-stimulatory molecule CD80 and major histocompatibility complex (MHC) molecules, when compared to standard mo-DCs. Furthermore, these matured DCs also secreted higher levels of IL- 12p70, essential for an efficient priming and polarization of Th1 cells and subsequent anti- tumor response. Overall, our data provides a strong contribution to the field of DC-based cancer immunotherapy, potentiating several key steps in the production of DC vaccines. We provided insight knowledge on their culture methods, loading with cancer antigens and new protocols of differentiation, contributing to the development of next-generation DC vaccines, a key tool for reaching robust and efficient clinical therapeutic responses in the global fight against cancer.

A área de imunoterapia oncológica cresce a um ritmo acelerado, com novos desenvolvimentos neste campo a levarem alterações de grande impacto no tratamento do cancro. Células dendríticas (DCs) são células do sistema imune com um papel fundamental na interface entre a imunidade inata e adquirida. A utilização de DCs em imunoterapia tem sido amplamente estudada, apresentando um enorme potencial translacional e clínico, com cerca de 400 ensaios clínicos focados em vacinas de DCs anti-tumorais. Apesar do excelente perfil de segurança da imunoterapia com DCs, a taxa de sucesso em induzir resultados terapêuticos objectivos é inconstante. Paralelamente ao crescente conhecimento da biologia celular e molecular num contexto oncológico, as abordagens baseadas em DCs deverão ser otimizadas, tendo em conta que maioria dos protocolos usados foram estabelecidos há mais de vinte anos. A produção de grau clínico de DCs derivadas de monócitos (mo-DCs) é a abordagem mais frequente no desenvolvimento de vacinas antitumorais. Normalmente, mo-DCs são diferenciadas a partir da cultura de monócitos com concentrações variáveis de GM-CSF e IL-4. No entanto, as mo-DCs não possuem as características funcionais e fenotípicas ideais necessárias para a indução de uma resposta imune antitumoral robusta. Pelo exposto, existe um grande espaço para o aprimoramento de protocolos e uma clara necessidade de estabelecimento de procedimentos clínicos operativos normalizados (CSOPs). As células estaminais cancerígenas (CSCs) são uma pequena população de células recentemente identificada e presentes no tumor, resistentes à rádio/quimioterapia e conhecidas por serem responsáveis pela recorrência da doença. Ou seja, o desenvolvimento de uma vacina de DCs direcionada contra CSCs poderá representar uma abordagem promissora na terapia oncológica. Neste estudo, pretendemos (1) contribuir para a padronização de CSOPs, (2) direcionar e erradicar CSCs através do desenvolvimento de uma abordagem de imunoterapia baseada em DCs direcionadas para essas células e (3) desenvolver novas combinações de cocktails para optimizar a diferenciação de DCs em subpopulações com características imunogénicas superiores relativamente às mo-DCs. Numa primeira abordagem, realizámos uma análise aprofundada sobre o impacto de meios de cultura de boas práticas de fabrico (GMP) na produção de DCs de grau clínico. DCs diferenciadas em meios de cultura distintos apresentaram diferentes capacidades fenotípicas e funcionais. A simples mudança do suporte nutritivo alterou o perfil das DCs de imunogénico para tolerogénico. É de realçar que as DCs produzidas em meios GMP apresentaram características diferenciadoras das geradas em RPMI/ meio pré-clínico. Estes resultados destacam a lacuna existente entre resultados pré-clínicos e a sua transposição para a clínica Numa segunda abordagem, carregamos as DCs com lisados de CSC e comparamos o perfil fenotípico e a capacidade destas DCs fazerem o priming de linfócitos T citotóxicos relativamente a DCs clássicas, carregadas com lisados tumorais totais. Os resultados preliminares obtidos demonstraram que as DCs carregadas com lisados de CSC pancreáticas foram capazes de desencadear uma efectiva e específica eliminação de CSCs. Estes resultados indicam que a nossa estratégia poderá ser eficaz para eliminar CSCs, uma população-chave de células tumorais. Por fim, a partir de duas análises de alto rendimento que incluíram 168 combinações iniciais, definimos dois novos cocktails de diferenciação que poderão ser alternativos aos protocolos convencionais de obtenção de mo-DCs, proporcionando a diferenciação de DCs em subpopulações com características aprimoradas. DCs diferenciadas com estes cocktails, C91 e C102, apresentaram um perfil de maturação superior por expressarem níveis mais elevados da molécula co-estimuladora CD80 e de moléculas do complexo major de histocompatibilidade (MHC), relativamente às mo-DCs padrão. Adicionalmente, estas DCs maduras também produziram níveis superiores de IL-12p70, citocina fundamental para a activação e expansão de linfócitos T citotóxicos e Th1 e, consequentemente, para uma resposta antitumoral eficaz. Em conclusão, os resultados obtidos constituem um contributo relevante na área da imunoterapia oncológica baseada em DCs, potenciando várias etapas importantes na produção de vacinas de DCs. Especificamente, produzimos conhecimento aprofundado sobre os seus métodos de cultura, carregamento com antigénio tumorais e diferenciação, contribuindo para o desenvolvimento de vacinas de DCs de próxima geração, uma ferramenta-chave para alcançar respostas clínicas terapêuticas robustas na luta global contra o cancro.