Metabolic Remodeling and Quality Control Mechanisms in Parkinson's Disease

Abstract

Parkinson’s Disease (PD) is the most common movement disorder and the second most common neurodegenerative disorder, having a prevalence of ~2% in people older than 65 years old. Currently, PD has no cure and no early diagnostic method exists. Considering the increase in average age of population, PD prevalence is predicted to increase in the next years. Pathologically, PD is characterized by loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) leading to a dopamine deficit in striatum. Although the exact mechanism by which PD develops and progresses is not still clear, there are evidences that mitochondrial dysfunction, impairment in quality control mechanism pathways and oxidative stress are implicated in PD pathogenesis. However, despite the increasing knowledge, there are still gaps that need to be filled for a better understanding, especially in the context of the PD sporadic form. Important questions remain unresolved, both regarding to an efficient diagnostic and therapeutics, as well as how others diseases might be a risk factor for PD. In this context, our first aim was to assess whether mitochondrial biology of human skin fibroblasts can be manipulated under standard or modified culture conditions. To do so, a glucose free/galactose/glutamine/pyruvate-containing media (OXPHOSm), that force cells to be more reliant on oxidative phophorylation (OXPHOS) for energy production, was used. The OXPHOSm could be used in a more reliable way to disclose mitochondrial liabilities of drug candidates or intrinsic metabolic differences in fibroblasts (Chapter 5). Our results showed that OXPHOSm forcing mitochondrial remodeling in human skin fibroblasts increased oxygen consumption rate, ATP levels, and mitochondria-related transcripts and proteins. Moreover, the metabolic remodeling towards a more oxidative state increased the susceptibility of fibroblasts to the cytotoxic effects of mitochondrial poisons. The chapter 5 highlights not only the importance of using human skin primary cells to study drug-induced mitochondrial toxicity, as reinforced the use of this tool to detect specific mitochondrial defects in skin fibroblasts from patients, including PD patients. Secondly, the sub-cellular events that lead to PD progression were investigate using non-neuronal cells, such as skin fibroblasts, in order to develop personalized interventions. These cells can be collected in a minimally invasive manner from diagnosed patients and be important tools to test pharmacological and non-pharmacological interventions aimed at improving mitochondrial function (Chapter 6). Human skin fibroblasts from sporadic PD (sPD) patients were used, as a cell proxy to detect metabolic and mitochondrial alterations. In this model, the same modified cell culture conditions previously described in Chapter 5 was used. Results demonstrated that fibroblasts from sPD patients show hyperpolarized and elongated mitochondrial networks paralled by an increased levels of mitochondrial reactive oxygen species (ROS) levels, as well as decreased ATP levels and glycolysis-related ECAR. Moreover, results also showed that abnormalities of fibroblasts from sPD patients became more evident when stimulating OXPHOS. Under these culture conditions, fibroblasts from sPD cells presented altered mitochondrial function, such as decreased basal respiration, ATP-linked OCR and maximal respiration, and increased mitochondria-targeting phosphorylation of DRP1 when compared to control cells. Chapter 6 validates the relevance of using fibroblasts from sPD patients to study cellular and molecular changes that are characteristic of dopaminergic neurodegeneration of PD and shows that forcing mitochondrial OXPHOS uncovers metabolic defects that were otherwise hidden. Taking into account the metabolic and mitochondrial defects in skin fibroblasts from sPD patients, a mitochondrial-directed intervention may significantly improve the cellular phenotype found in sPD (Chapter 7). Thus, a mitochondria-targeted hydroxycinnamic acid derivative (AntiOxCIN4), presenting antioxidant and iron-chelating properties, which showed to prevent oxidative stress-induced damage in several biological models of disease was evaluated in skin fibroblasts from sPD patients. The results demonstrated that treatment of human skin fibroblasts from sPD patients with a non-lethal concentration of AntiOxCIN4 restored mitochondrial membrane potential and mitochondrial fission, decreased autophagic flux, and improved cellular responses to oxidative stress by improving the cellular redox state (GSH levels) and decreasing ROS levels. In addition, fibroblasts from sPD patients treated with AntiOxCIN4 showed increased maximal respiration and metabolic activity, converting the phenotype of sPD fibroblasts more similar to their sex- and age-matched controls. Chapter 7 led to a more deep understanding on AntiOxCIN4 mechanism of action in skin fibroblasts from sPD patients and points out that mitochondria-targeted antioxidants based on a polyphenol scaffold are potential drug candidates for delaying PD progression. The data also validates the use of fibroblasts from sPD patients with more active OXPHOS as platforms for mitochondria-based drug candidates for delaying PD progression. The data also validates the use of fibroblasts from sPD patients with more active oxidative phosphorylation as platforms for mitochondria-based drug development. Lastly, the work focused on how others diseases, namely lysosomal storage disorders (LSDs) could be a risk factor for PD. In this context, the fourth aim was to evaluate whether lysosomal malfunction alters authophagy and triggers proteasomal saturation and accumulation of protein aggregates leading to molecular features which are characteristic from PD (Chapter 8). To do so, an acid α-glucosidase (GAA) knockout model was used. Preliminary data showed that lysosomal dysfunction associated with GAA deficiency triggers autophagic pathway in the brain and induces some pathological hallmarks of PD, such as α-synuclein protein content increased, decreased metabolic activity, and induction of mitophagy, suggesting mitochondrial alterations. Overall, the results obtained in this dissertation added novel and relevant knowledge not only by showing the importance of using human skin primary cells for personalized medicine, particularly to detect specific mitochondrial defects in sPD patients, as well as, to validate a mitochondria-directed antioxidant intervention based on dietary phenolic acid antioxidant as a potential therapeutic tool to revert some PD-associated mitochondrial defects. Additionaly, the work presented in this dissertation also added knowledge in how dysfunctional lysosomes impact quality control mechanisms and induce molecular features which are characteristic of PD, giving new insights of how others LSDs might be a risk factor for PD.

A doença de Parkinson (DP) é a doença mais comum a afetar a coordenação de movimentos e a segunda doença como doença neurodegenerativa, apresentando uma prevalência de ~ 2% em pessoas com mais de 65 anos. Actualmente, a DP não tem cura e nem existe nenhum método que permita um diagnóstico precoce. Considerando o aumento na idade média da população, prevê-se que a prevalência da DP aumente nos próximos anos. Patologicamente, a DP é caracterizada pela perda de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNpc) levando a uma diminuição dos níveis de dopamina no corpo estriado. Embora o mecanismo exato pelo qual isso ocorre ainda não seja completamente conhecido, há evidências de que a disfunção mitocondrial, alterações nas vias dos mecanismos de controlo de qualidade celulares e o stress oxidativo contribuem para a patogénese da DP. Apesar do crescente conhecimento sobre a DP, várias lacunas precisam ser colmatadas para um melhor entendimento da patofisiologia desta doença, em particular para a forma esporádica. Questões pertinentes permanecem sem resposta, tanto no que diz respeito ao diagnóstico ou a uma terapêutica eficaz, como em relação a compreender se a existência de outras doenças pode ser um fator de risco para o desenvolvimento da DP. Neste contexto, o nosso primeiro objetivo foi avaliar a biologia mitocondrial de fibroblastos da pele humana em condições de cultura padrão ou modificadas usando um meio de cultura sem glucose e que contém galactose/glutamina/piruvato o qual força os fibroblastos a dependerem mais da fosforilação oxidativa para a produção de energia. Esta estratégia permitirá de um modo mais confiável descobrir disfunções mitocondriais na toxicidade de compostos candidatos a fármacos ou mesmo revelar diferenças metabólicas intrínsecas em fibroblastos de diferentes dadores (Capítulo 5). Os resultados mostraram que forçar a remodelação mitocondrial nos fibroblastos da pele humana causou um aumento da taxa de consumo de oxigénio, dos níveis de adenosina trifosfato (ATP) e dos transcritos e proteínas relacionados com as mitocôndrias. Além disso, a remodelação metabólica para um estado mais oxidativo intensificou a citotoxicidade de tóxicos mitocondriais. O capítulo 5 não só destacou a relevância do uso de células primárias da pele humana para o estudo da toxicidade mitocondrial induzida por possíveis fármacos, mas também reforça o uso desta ferramenta e abordagem para encontrar defeitos mitocondriais específicos em fibroblastos da pele de pacientes, incluindo pacientes com a DP. O segundo objetivo foi investigar os eventos subcelulares que causam a progressão da DP e desenvolver intervenções personalizadas, usando células não neuronais, recolhidas de uma forma menos invasiva, e que podem ser fundamentais para testar intervenções destinadas a melhorar a função mitocondrial (Capítulo 6). Usamos fibroblastos da pele humana de pacientes com a DP esporádica como modelo celular para detetar alterações metabólicas e mitocondriais. Neste modelo, usamos a estratégia de cultivo de células descrita no capítulo 5. Demonstramos que os fibroblastos de pacientes com a DP esporádica apresentam uma rede mitocondrial hiperpolarizada e alongada exibindo um conteúdo aumentado de espécies reativas de oxigênio mitocondriais, bem como uma diminuição dos níveis de ATP e da taxa de acidificação extracelular relacionado com a glicólise. Os nossos resultados também mostraram que as anomalias dos fibroblastos de pacientes com a DP esporádica tornaram-se mais evidentes quando a fosforilação oxidativa foi estimulada. Nessas condições de cultura celular, os fibroblastos das células de DP esporádica exibiram uma diminuição da respiração basal, da taxa de consumo de oxigénio associada à produção de ATP e da respiração máxima, e apresentaram um aumento da fosforilação da proteina DRP1, quando comparados às células de indivíduos do grupo controlo. Esta parte do trabalho validou a relevância do uso de fibroblastos da pele de pacientes com a DP esporádica para estudar alterações celulares e moleculares que são características da neurodegeneração dopaminérgica que ocorre na DP e demonstrou que forçar a fosforilação oxidativa mitocondrial revela defeitos metabólicos que de outra forma permaneceriam ocultos. Tendo em consideração as alteracões metabólicas e mitocondriais presentes nos fibroblastos de pacientes com a DP esporádica, uma intervenção direccionada à mitocôndria pode significativamente melhorar o fenótipo encontrado nessas mesmas células. Assim, um derivado do ácido hidroxicinâmico direcionado à mitocôndria (AntiOxCIN4), o qual apresenta propriedades antioxidantes e quelantes de ferro, que previne o stress oxidativo em diversos modelos biológicos de doença, foi testado em fibroblastos da pele de pacientes com a DP esporádica (Capítulo 7). Os nossos resultados demonstraram que o tratamento dos fibroblastos da pele de pacientes com a DP esporádica com uma concentração não letal de AntiOxCIN4 restaurou o potencial de membrana mitocondrial e a fissão mitocondrial, diminuiu o fluxo autofágico e melhorou a resposta celular ao stress oxidativo, melhorando o estado redox celular (níveis de glutationa reduzida, GSH) e diminuindo as espécies reativas de oxigénio (ERO). Além disso, os fibroblastos de pacientes com a DP esporádica tratados com o AntiOxCIN4 exibiram um aumento da respiração máxima e da atividade metabólica, convertendo o fenótipo dos fibroblastos com DP esporádica mais semelhantes aos seus controlos de igual sexo e idade. Estes dados apontaram um possível mecanismo de ação do AntiOxCIN4 permitindo um entendimento mais profundo de como o uso de antioxidantes direcionados para a mitocôndria, com base numa arcabouço de polifenol, apresentam potencial terapêutico para serem usados como novos fármacos para retardar a progressão da DP. Os resultados obtidos também validam o uso da estratégia do cultivo de fibroblastos de pacientes com DP esporádica em condições que forçam a fosforilação oxidativa como uma plataforma para o desenvolvimento de medicamentos que tenham a mitocôndria como alvo, visto que os seus efeitos pretendidos ou colaterais serão evidenciados. Por último, estudamos como outras doenças, particularmente doenças do armazenamento lisossomal (DALs), podem ser um fator de risco para o desenvolvimento da DP. Nesse contexto, o nosso quarto objetivo foi avaliar se a disfunção lisossomal, recorrendo a um modelo animal sem α-glucosidase ácida (silenciamento total por knockout), alterará o fluxo autofágico desencadeiando a saturação proteassomal e a acumulação de agregados proteicos causando padrões moleculares característicos da DP (Capítulo 8). Os nossos resultados preliminares evidenciaram que a disfunção lisossomal associada à deficiência da α-glucosidase ácida estimula a via autofágica no cérebro e induz algumas das características patológicas da DP, tais como o aumento do conteúdo da proteína α-sinucleína, a diminuição da atividade metabólica e a estimulação da mitofagia, sugerindo a ocorrência de alterações mitocondriais. Os resultados obtidos nesta tese acrescentaram conhecimento inovador e pertinente sobre a DP; não só validam a importância do uso de células primárias da pele humana para uma medicina personalizada, em particular para detectar disfunções mitocondriais em doentes com a DP e avaliar a eficácia de possíveis tratamentos, como também permitiram validar o uso de um composto com base num antioxidante presente na dieta humana como uma molécula com potencial terapêutico para reverter alguns dos defeitos das linhas celulares de DP possibilitando a utilização desse conhecimento no desenvolvimento de novos fármacos. Além disso, o trabalho apresentado nesta tese também acrescentou conhecimento de como a acumulação de lisossomas disfuncionais influencia os mecanismos de controlo de qualidade celular e induzem atributos moleculares característicos da DP, apontando que outras doenças e/ou DALs podem ser um fator de risco para o desenvolvimento da DP.