Analysis of the hippocampal and cortex proteome of mice exposed to psychotropic medication

Abstract

Psychotic disorders are very serious and costly mental diseases. Throughout the years the understanding of the genetic basis of these illnesses has improved considerably but there is only rudimentary knowledge of its pathophysiology, mostly due to inconsistent results and confounding factors. In the case of schizophrenia, the disease is characterized by a combination of positive, negative and cognitive symptoms, and throughout the literature several explanations for the origin of the disorder have emerged, such as the dopaminergic, glutamatergic or serotoninergic hypotheses. The treatment of these disorders consists essentially in the chronic treatment with antipsychotics, sometimes accompanied by psychosocial or even electroconvulsive therapy. The study of alterations triggered by antipsychotic medication is essential to better understand their action, but also to elucidate targets to study psychosis physiology and treatment. Having all this in mind, two antipsychotics were selected for this project: haloperidol and clozapine, first and second-generation antipsychotics, respectively. Haloperidol is believed to act essentially in dopamine D2 receptors, and clozapine, along with softer action in D2 receptors, also has affinity for serotonin and other receptors. Haloperidol is effective against positive symptoms, while clozapine has shown effectiveness in positive symptoms, even in treatment-refractory patients, and is believed to have some efficacy against negative symptoms also. The main goal of this project was to investigate the differential protein expression in the rodent brain following chronic exposure to commonly prescribed psychotropic medication, in order to distinguish between pharmacological and disease-related changes and correlate expression profiles with drug effects. A state-of-the-art quantitative proteomics approach, SWATH-MS, was used to quantify the proteome of the prefrontal cortex (PFC) and hippocampus of mice chronically exposed to both antipsychotics. In the case of haloperidol, striatum was also studied. With this approach thousands of proteins were identified in all experimental groups, enabling the creation of representative protein libraries. With these libraries and using the SWATH approach, more than 1000 proteins were confidently quantified in each tissue, which upon the application of quality and statistical filters some of the proteins were considered as significantly modulated by the drugs. By applying a principal component analysis to these altered proteins, the distinction between control and medicated groups was achieved, giving further validity to the results here presented. Functional, ontological and correlation analysis were performed leading to the conclusion that many of the altered proteins are related to metabolic processes, suggesting a metabolic shift caused by the two drugs. Also, many of the modulated proteins are involved in several synaptic systems, with special focus to the GABAergic system, and the synaptic vesicle cycle. Interestingly, in the PFC and hippocampus of the mice exposed to haloperidol several protein subunits belonging to the translation machinery were found to be altered. In summary, this study shows indication about the mechanism of action of long-term antipsychotic exposure, hinting to the fact that similar pathways are modulated by both drugs but in different ways and extents. This study may help to choose possible target molecular pathways for the investigation of psychotic schizophrenia’s physiology and treatment.

As doenças psicóticas são doenças muito sérias e economicamente desgastantes. Ao longo dos anos o conhecimento das bases genéticas destas doenças tem melhorado consideravelmente mas o conhecimento da sua patofisiologia continua rudimentar, especialmente devido a resultados inconsistentes e diferentes variáveis na estrutura dos estudos. No caso da esquizofrenia, a doença é caracterizada pelo combinação de sintomas positivos, negativos e cognitivos, e na literatura é possível encontrar várias explicações para o surgimento da doença, nomeadamente as hipóteses dopaminérgica, glutamatérgica e serotoninérgica. O tratamento destas doenças consiste essencialmente na toma crónica de antipsicóticos, por vezes acompanhada por terapia psicossocial ou até electroconvulsiva. O estudo das alterações provocadas pela medicação antipsicótica é essencial para melhor compreender o seu mecanismo de ação, mas também para elucidar alvos para o estudo da fisiologia da psicose e seu tratamento. Tendo toda esta informação em conta, 2 antipsicóticos foram selecionados para este projeto: haloperidol e clozapina, antipsicóticos de primeira e segunda geração, respetivamente. O haloperidol é conhecido por atuar essencialmente nos recetores D2 de dopamina, e a clozapina, para além de uma atuação mais suave nestes, tem também afinidade para outros recetores. O haloperidol é eficaz contra os sintomas positivos, enquanto que a clozapina tem mostrado eficácia contra os sintomas positivos, até em doentes refratários, e pensa-se que apresenta também alguma eficácia contra sintomas negativos. O principal objetivo deste projeto foi investigar a expressão diferencial de proteínas no cerébro de ratinhos após a exposição crónica a medicação antipsicótica comummente prescrita, de forma a distinguir entre as alteração que advém da medicação das que advém da doença e de forma a correlação estes níveis de expressão com os efeitos dos medicamentos. A abordagem de última geração para a proteómica quantitativa, SWATH-MS, foi utilizada para quantificar o proteoma do córtex pré-frontal e hipocampo de ratinhos que foram expostos a ambos os antipsicóticos. No caso do haloperidol o estriado também foi estudado. Com esta abordagem foi possível identificar milhares de proteínas em todos os grupos experimentais, permitindo a criação de bibliotecas de proteínas representativas de cada um. Com estas bibliotecas e utilizando a abordagem SWATH, foi possível quantificar com confiança mais de 1000 proteínas em cada tecido em estudo, em que algumas foram consideradas como significativamente moduladas pelos medicamentos após a aplicação de filtros de qualidade e estatísticos. Após a aplicação de uma análise de componentes principais utilizando estas proteínas consideradas alteradas, foi possível atingir uma separação entre grupos experimentais, conferindo maior validade aos resultados apresentados. Análises funcionais, de ontologia e de correlação foram aplicadas, permitindo concluir que muitas das proteínas alteradas estão relacionadas com processos metabólicos, sugerindo que existe uma alteração metabólica provocada por estes medicamentos. Mais se verificou que muitas das proteínas moduladas estão envolvidas em diferentes sistemas sináticos, especialmente no sistema GABAérgico, e no ciclo das vesiculas sinápticas. Foi interessante observar que, tanto no córtex pré-frontal como do hipocampo dos ratinhos expostos a haloperidol, várias subunidades proteicas pertencentes à maquinaria de tradução foram consideradas alteradas. Em suma, este estudo mostra indicações de qual o mecanismo de ação da exposição prolongada a antipsicóticos, mostrando evidências para o facto de que vias semelhantes são moduladas por ambos os medicamentos mas de formas e níveis diferentes. Este estudo tem o potencial de ajudar a escolher vias moleculares para continuar o estudo da fisiologia e tratamento da esquizofrenia.