Metabolomics, Genetics and Environment: a Novel Integrative Approach to Age-related Macular Degeneration

Abstract

Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly in developed countries. The presence of macular drusen or pigmentary changes represent the early phases of the disease, with some subjects progressing to its late forms - choroidal neovascularization or geographic atrophy. The diagnosis and management of AMD currently relies on ophthalmic examination and/or imaging by skilled clinicians. As it is often asymptomatic in its early phases, unless a routine exam is done, AMD early/ intermediate stages may remain undetected. Therefore, it is crucial to develop screening tools for AMD diagnosis and to predict its progression. Several attempts have been made to identify serologic biomarkers of AMD. However, probably due to the complex multifactorial nature of this disease, involving interactions between genetic and environmental risk factors, results have been inconsistent. Thus, there is currently a lack of reliable and accessible AMD biofluid biomarkers. Metabolomics, the study of the small molecules (<1 kDa) comprising a biological system, offers a well-suited tool to address this need. The metabolites are the downstream product of the cumulative effects of the genome and its interaction with environmental exposures. Therefore, the metabolome is thought to closely mirror the phenotype, especially of multifactorial diseases, such as AMD. Metabolomic profiles can be assessed with two main techniques: nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and mass spectrometry (MS). Our group hypothesized that the metabolome is impacted in AMD, with differences according to its severity stages, and that AMD-progressors have a distinct metabolome. To test our hypotheses, we designed a study including subjects with AMD and a control group (> 50 years with normal macula) from two distinct geographic origins (Coimbra, Portugal and Boston, United States). In addition to a complete ophthalmological exam, we obtained medical history and lifestyle profiles. Fasting blood and urine samples were collected on all subjects, and detailed imaging of the retina, including color fundus photographs (CFP) and optical coherence tomography (OCT), was performed. For a subset of patients, functional assessments, such as dark adaptation, were also obtained. Our initial work focused on the characterization of metabolomic profiles of AMD and its severity stages. Using NMR spectroscopy, we observed a separation of plasma metabolomics profiles between multiple AMD stages for the Boston cohort, and between control and late stages of AMD for the Coimbra cohort. The metabolomic fingerprints of AMD in the two cohorts presented both similarities and differences, thus suggesting the existence of specific signs of the disease and signs of environmental influences, respectively. We are currently finalizing the analysis of urine NMR metabolomic profiles. Compared to blood, urine composition can present greater variations of endogenous metabolites, therefore it may better reflect changes in disease. The encouraging results of the NMR study motivated us to pursue work with MS, a complementary technique with higher sensitivity. A pilot analysis of plasma samples of the Boston cohort using MS revealed that 87 metabolites differed significantly between patients with AMD and controls. Most of them were lipids, with glycerophospholipids playing a major role. Of these metabolites, over half also differed significantly across AMD severity stages. We are now analyzing the remaining plasma MS data (n=500), by using our two independent cohorts (Coimbra and Boston) as a training and validation set, to characterize metabolomic signs of the disease. In our study, AMD classification was based on CFP, the current gold-standard. Due to the variability of CFP on brightness and contrast, we developed software to automatically standardize them. We also did pioneering work in defining structure-functional associations in AMD, namely by studying the relation between OCT features of AMD with visual function, as assessed by dark adaptation. Acknowledging the potential relevance of peripheral changes on AMD, we also defined methodology to assess them using ultra-widefield imaging.

In conclusion, this project demonstrated for the first time that metabolomics enables the identification of plasma profiles associated with AMD, thus supporting the development of metabolomic biomarkers of this blinding disease. Integrated with genetic and lifestyle information, this work also has the potential to increase the current knowledge on the mechanisms of AMD, and thus point to druggable targets for its treatment.

A degenerescência macular relacionada com a idade (DMI) é a causa líder de cegueira em idosos nos países desenvolvidos. As fases precoces da doença caracterizam-se pela presença de drusen maculares ou alterações pigmentares; alguns indivíduos progridem para as formas tardias – neovascularização coroideia ou atrofia geográfica. O diagnóstico e seguimento da DMI é atualmente baseado num exame oftalmológico efetuado por clínicos experientes e/ou em exames de imagem. Como frequentemente os doentes com DMI são assintomáticos nas suas fases precoces, exceto se um exame de rotina for efetuado, aqueles com estadios precoces ou intermédios podem permanecer por diagnosticar. Assim, é essencial desenvolver ferramentas para rastreio da DMI e para predizer o seu risco de progressão. Várias tentativas têm sido efetuadas para identificar biomarcadores serológicos de DMI. No entanto, provavelmente devido à complexa natureza multifatorial da doença, que envolve fatores genéticos e ambientais, os resultados dos diversos estudos têm sido inconsistentes. Deste modo, não existem atualmente biomarcadores de DMI acessíveis e fidedignos. A metabolómica, definida como o estudo das pequenas moléculas (<1KDa) que formam um sistema, representa uma ferramenta apropriada para enfrentar este desafio. Os metabolitos são o produto último do processo de transcrição genética e das suas interações com as exposições ambientais. Assim sendo, pensa-se que o metaboloma é a representação mais próxima do fenótipo, especialmente em doenças multifatoriais, como a DMI. Os perfis metabolómicos podem ser estudos com duas técnicas principais: espetroscopia por ressonância magnética e espetrometria de massa (MS). O nosso grupo colocou a hipótese de que o metaboloma está alterado na DMI, com diferenças de acordo com os estadios de gravidade da doença, e que os indivíduos que progridem ao longo do tempo (progressores) têm um metaboloma distinto. Para avaliar as nossas hipóteses, desenhámos um estudo que incluiu doentes com DMI e um grupo controlo (>50 anos, mácula normal), de duas origens geográficas distintas (Coimbra, Portugal e Boston, Estados Unidos). Para além de um exame oftalmológico completo, efetuámos a todos os participantes uma história clínica completa e colhemos dados sobre o seu estilo de vida, bem como amostras de sangue e de urina em jejum. Efetuados ainda vários exames de imagem, incluindo retinografias e tomografia de coerência óptica (OCT). Para um subgrupo de doentes, efetuámos também avaliações funcionais, nomeadamente adaptação ao escuro. O nosso trabalho inicial focou-se na caracterização do perfil metabolómico da DMI e dos seus diversos estadios. Utilizando espetroscopia por ressonância magnética, verificámos a presença de uma separação entre os perfis metabolómicos do plasma de vários estadios de DMI, na coorte de Boston. Na coorte portuguesa, verificámos uma separação entre doentes com DMI tardia comparativamente com o grupo controlo. Os perfis metabolómicos nas duas coortes demonstraram tanto semelhanças como diferenças, sugerindo deste modo a existência tanto de sinais específicos da doença como ambientais. Estamos atualmente a finalizar a análise dos perfis metabolómicos de urina utilizando a mesma técnica. Comparada com o sangue, a urina pode apresentar maiores variações de metabolitos endógenos, pelo que pode refletir melhor alterações na doença. Os resultados encorajadores com espetroscopia por ressonância magnética, motivaram-nos a prosseguir o nosso estudo com MS - uma técnica complementar, com maior sensibilidade. Com esta técnica, a nossa análise inicial de amostras de plasma da coorte de Boston demonstrou que 87 metabolitos diferiam significativamente entre doentes com DMI e controlos. A maioria dos metabolitos responsáveis por esta separação eram lípidos, sobretudo glicero-fosfolípidos. Destes metabolitos, mais de metade diferiam também entre os diferentes estadios de DMI. Neste momento, estamos a terminar a análise dos restantes dados obtidos com MS (n= 500), utilizando as nossas duas coortes independentes (Coimbra e Boston) como grupo de teste e de validação, para caracterizar os sinais metabolómicos da DMI. Neste estudo, a classificação de DMI foi baseada em retinografias, já que estas são atualmente o gold-standard. Devido à variabilidade verificada nas mesmas em termos de brilho e contraste, desenvolvemos um programa para as estandardizar automaticamente. Efetuámos também trabalho pioneiro na definição de associações estrutura-função na DMI, nomeadamente através do estudo da relação entre as alterações observadas no OCT e a função visual avaliada através da adaptação ao escuro. Devido ao reconhecimento da potencial relevância das alterações da periferia na DMI, definimos também metodologia para as avaliar utilizando imagens com amplo campo de captação.

Em conclusão, este projeto demonstrou pela primeira vez que utilizando metabolómica é possível identificar perfis plasmáticos associados à DMI, suportando assim o desenvolvimento de biomarcadores metabolómicos desta doença. Integrado com o estudo genético e de perfis de vida, este trabalho tem também o potencial de aumentar o atual conhecimento dos mecanismos de DMI e de identificar potenciais novos alvos terapêuticos.