Mycobacterial methylmannose polysaccharides’ biosynthesis

Abstract

In recent years, there has been an increasing number of mycobacterial infections caused by nontuberculous mycobacteria (NTM) mostly associated with comorbidities such as HIV infection, underlying pulmonary diseases or diabetes. Moreover, the urgency to fight mycobacterial diseases is intensified by their drug resistance and lack of specific antibiotics against NTM. A major adaptive advantage of members of the Mycobacterium genus stems from the composition and arrangement of their cell envelope that confers the ability to persist and survive under adverse conditions, contributing to their virulence and pathogenicity. Additionally, mycobacteria possess two unusual intracellular polymethylated polysaccharides (PMPS) of 6-O-methylglucose (MGLP) and 3-O-methylmannose (MMP). These are distributed differently through mycobacterial species, MGLP appears to be synthetized by all known mycobacteria and MMP was only isolated from rapidly growing mycobacteria (RGM). PMPS were proposed to modulate mycobacterial fatty-acid metabolism and indirectly the assembly of cell envelope lipids and glycoconjugates, but the importance of MMP for mycobacterial fitness in the environment or during infection has raised important issues. Since PMPS are considered potential drugs targets, it is crucial to expand the knowledge of their functions and details of their biosynthetic pathways. A biosynthetic pathway for MMP was proposed in 1984 where MMP polymerization would occurs through alternating mannosylation and methylation reactions catalysed by a mannosyltransferase and a methyltransferase, respectively. Recently, an alternative pathway was proposed wherein mannosyltransferase activity would be independent of mannose methylation, allowing the addition of successive mannose units prior to methylation. However, the genes and enzymes involved in MMP biosynthesis are unknown. In this work, a mycobacterial gene cluster, composed by four genes, was proposed to be responsible for MMP biosynthesis. Of the four enzymes, three were biochemically characterized as a MMP hydrolase (MmpH), as an α-(1→4)-mannosyltransferase (ManT) and as a 1-O-methyltransferase (MeT1), strongly indicating their involvement in MMP biosynthesis. Moreover, the three-dimensional structure of MeT1 was determined. The identification of these genes, the features of each of the enzymes and their in vitro cooperation favour their commitment to the MMP biosynthetic pathway herein described, which contributes to further the knowledge about this polysaccharide. These results can now be used to better understand the physiological role of MMP in mycobacteria as well as its possible involvement in growth, resilience and pathogenesis.

Ao longo dos últimos anos tem-se verificado um aumento de infeções provocadas por micobactérias não-tuberculosas (NTM), principalmente associadas a comorbidades como infeção por HIV, doenças pulmonares subjacentes ou diabetes. Para além disso, a resistência das micobactérias aos anti-micobacterianos existentes e a falta de antibióticos específicos para NTM intensifica a necessidade de combater estas bactérias. Uma grande vantagem adaptativa do género Mycobacterium deriva da composição e organização da sua parede celular, conferindo-lhe a capacidade de persistir e sobreviver em condições adversas e, assim, também contribuir para a sua virulência e patogenicidade. Adicionalmente, as micobactérias possuem dois polissacáridos polimetilados intracelulares (PMPS) raros de 6-O-metilglucose (MGLP) e 3-O-metilmanose (MMP). Os PMPS encontram-se distribuídos de forma distinta pelas diferentes espécies de micobactérias, sendo que o MGLP parece ser sintetizado por todas as micobactérias enquanto que o MMP apenas foi isolado de micobactérias de crescimento rápido (RGM). A função destes polímeros está relacionada com a modulação do metabolismo dos ácidos gordos em micobactérias e, indiretamente, com a síntese de lípidos e glicoconjugados do envelope celular. Contudo, a importância do MMP na capacidade adaptativa das RGM a condições ambientais desfavoráveis ou durante o desenvolvimento de infeções tem sido alvo de questões importantes. Assim, os PMPS são considerados potenciais alvos terapêuticos, sendo essencial expandir o conhecimento acerca da sua função e das vias de biossíntese. A via de biossíntese dos MMP foi proposta em 1984, onde a polimerização ocorreria através de reações alternadas de manosilação e de metilação catalisadas por uma manosiltransferase e uma metiltransferase, respetivamente. Recentemente, foi proposta uma via alternativa onde a atividade de uma manosiltransferase seria independente da metilação das manoses por uma metiltransferase, permitindo adicionar sucessivamente unidades de manose antes da sua metilação. Todavia, não existem mais evidências acerca da síntese de MMP nem dos genes ou das enzimas envolvidas no processo. Neste trabalho propomos um conjunto de quatro genes que identificámos no genoma de micobactérias e que é responsável pela síntese de MMP. Das quatro enzimas, três foram caracterizadas bioquimicamente, designadamente uma MMP hidrolase (MmpH), uma α-(1→4)-manosiltransferase (ManT) e uma 1-O-metiltransferase (MeT1), demonstrando-se assim o seu envolvimento na biossíntese do MMP. A estrutura tridimensional da MeT1 foi também determinada. Assim, a identificação dos genes, a determinação das propriedades de cada enzima e a sua cooperação in vitro a favor da síntese de MMP aqui descritas contribuem para melhorar o conhecimento sobre este polissacárido, fornecendo pistas cruciais para a compreensão da função fisiológica de MMP bem como do seu possível envolvimento no crescimento, resiliência e patogénese das micobactérias que o sintetizam.