Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/87491
Title: Synaptic Zinc Changes in Hippocampal CA3 Area
Authors: Neves, Fátima Maria Castelo Bastos da Silva
Orientador: Quinta-Ferreira, Maria
Keywords: Hipocampal CA3 area; Mossy fiber synapses; Glutamate; Fluorescent zinc indicator; Newport Green (NG); KCl depolarization; Tetraethylammonium (TEA); ATP-sensitive potassium channels (KATP); Tolbutamide; Autofluorescence; Flavoproteins; Área CA3 do hipocampo; Sinapses das fibras musgosas; Glutamato; Indicador fluorescente de zinco; Newport Green (NG); Despolarização por KCl; Tetraetilamónio (TEA); Canais de potássio sensíveis ao ATP (KATP); Tolbutamida; Autofluorescência; Flavoproteínas
Issue Date: 8-Mar-2019
Abstract: The aim of this work was to study neuronal zinc changes, evoked by depolarizing media, at the hippocampal mossy fiber synapses from CA3 area. These synapses contain one of the largest concentrations of vesicular zinc in the central nervous system and also a high density of presynaptic ATP-sensitive potassium (KATP) channels. Zinc ions play a key role in numerous cellular processes including neurotransmission, the activation of metalloproteins and gene expression. At those synapses zinc is co-released with glutamate into the synaptic cleft, in a calcium dependent way, following electrically or chemically induced mossy fiber depolarization. Released zinc may then interact with various pre- and postsynaptic ionic and receptor-operated channels and have an important neuromodulatory role. In this study chemically evoked zinc signals were measured using the permeant form of the fluorescent zinc indicator Newport Green (Kd = 1 μM), at the zinc-enriched mossy fiber synapses from hippocampal slices (400 μm). In the first set of experiments (Part III), basal fluorescence signals from non-incubated and from Newport Green loaded slices, perfused with the normal extracellular medium, were detected. Their analysis reveals the existence of a constant autofluorescence component, representing approximately 75 % of the fluorescence intensity measured from incubated slices. A large fraction of this work addressed zinc changes induced by depolarizing KCl media. In order to determine the origin of these signals, antagonists of AMPA/KA and NMDA receptors and a blocker of voltage dependent calcium channels were applied extracellularly. The drugs used, NBQX (10 µM), D-APV (50 μM) and nifedipine (10 μM), respectively, largely decreased the amplitude of the KCl (60 mM) evoked signals, suggesting that they have a postsynaptic origin. In the presence of KCl (20 mM and 60 mM) solutions, the zinc transients exhibited a clear enhancement which, upon washout, was reduced or maintained, respectively. The signals associated with a second application of KCl (20 mM) were similar to those of the first one. However, the amount of steady potentiation observed for the KCl (60 mM) solution was maintained following washout, including during a second KCl (60 mM) application, but increased when it was combined with 1 mM ZnCl2. In the second group of experiments (Part IV), the effect of the voltage dependent potassium channel blocker tetraethylammonium (TEA), on zinc signals obtained with the same indicator, was studied. The TEA (25 mM) solution caused a depression of the zinc signals with respect to baseline, which recovered in the normal medium. It has been shown that released zinc activates the mossy fiber KATP channels, leading to rapid presynaptic membrane hyperpolarization. This should cause a reduction in glutamate and zinc release and, consequently, in postsynaptic zinc entry. This issue was tested comparing the zinc signals from two sets of consecutive TEA (25 mM) applications, one of which included the KATP channel inhibitor tolbutamide, The signals obtained in the presence of this drug had a smaller amplitude, supporting the idea that the KATP channels mediate, at least in part, the observed depression. In the last part of the work (Part V), flavoprotein associated autofluorescence changes, evoked by KCl (20 mM) and TEA (25 mM), were compared with those from NG incubated slices. The two depolarizing compounds, gave rise to opposite time varying autofluorescence signals, which were potentiated in the case of KCl and depressed for TEA, as found for the zinc signals, suggesting the existence of a close relationship between the autofluorescence and zinc changes. The measurements from NG loaded slices include a time variable autofluorescence component and a NG-zinc component. Under the experimental conditions used the first component is considered to have flavoprotein origin, reflecting FAD levels and the redox metabolic state of mitochondria. The real zinc signal was obtained subtracting, point to point, the autofluorescence from the total fluorescence signals. In the presence of tolbutamide the calculated zinc changes are largely reduced with respect to those obtained without the blocker. This fact supports the idea that, at the hippocampal mossy fiber synapses, a KATP mediated zinc action contributes to the neuroprotective role of zinc under conditions of intense synaptic stimulation.
O objetivo deste trabalho consistiu no estudo de variações neuronais de zinco, induzidas por meios despolarizantes, nas sinapses das fibras musgosas da área CA3 do hipocampo. Estas sinapses contêm uma das maiores concentrações de zinco vesicular no sistema nervoso central e também uma elevada densidade de canais pré-sinápticos de potássio sensíveis ao ATP (KATP). Os iões de zinco têm um papel fundamental em inúmeros processos celulares, incluindo a neurotransmissão, a activação de metaloproteínas e a expressão genética. Naquelas sinapses o zinco é co-libertado com o glutamato na fenda sináptica, duma forma dependente do cálcio, após a despolarização das fibras musgosas induzida elétrica- ou quimicamente. O zinco libertado pode então interagir com diversos canais iónicos e de receptores, pré- e pós-sinápticos e ter um papel neuromodulador importante. Neste estudo mediram-se sinais de zinco induzidos quimicamente usando a forma permeante do indicador de zinco fluorescente Newport Green (Kd = 1 µM), nas sinapses das fibras musgosas de fatias do hipocampo (400 µm), que são ricas em zinco. No primeiro conjunto de experiências (Parte III) foram detetados sinais de fluorescência basal, de fatias não incubadas ou contendo o indicador Newport Green, perfundidas com o meio extracelular normal. A sua análise revela a existência de uma componente constante de autofluorescência, representando aproximadamente 75% da intensidade de fluorescência das fatias incubadas. Uma grande parte deste trabalho abordou variações de zinco induzidas por meios de KCl despolarizantes. A fim de determinar a origem destes sinais, aplicaram-se extracelularmente antagonistas de receptores de AMPA/KA e NMDA e um bloqueador de canais de cálcio dependentes do potencial. Os compostos utilizados, respetivamente NBQX (10 µM), D-APV (50 µM) e nifedipine (10 µM), reduziram bastante a amplitude dos sinais induzidos por KCl (60 mM), sugerindo que eles têm uma origem pós-sináptica. Na presença de soluções de KCl (20 mM e 60 mM) os sinais de zinco exibiram um aumento claro que, após a remoção da solução foi, respetivamente reduzido ou mantido. Os sinais associados a uma segunda aplicação de KCl eram semelhantes aos da primeira. No entanto, o valor da potenciação estacionária observada para a solução de KCl (60 mM) manteve-se após a sua remoção, incluindo durante uma segunda aplicação de KCl (60 mM), mas aumentou quando ela incluía 1 mM ZnCl2. No segundo grupo de experiências (Parte IV), estudou-se o efeito do bloqueador dos canais de potássio dependents do potencial tetraetilamónio (TEA), em sinais dezinco obtidos como mesmo indicador. A solução de TEA (25 mM) originou uma depressão dos sinais de zinco relativamente à linha base, que recuperou no meio normal. Mostrou-se já que o zinco libertado ativa os canais de KATP das fibras musgosas, levando rapidamente a uma hiperpolarização da membrana pre-sinática. Isto deveria causar uma redução na libertação de glutamate e de zinco e, consequentemente, na entrada de zinco pós-sinático. Esta questão foi testada comparando os sinais de zinco de dois conjuntos de aplicações consecutives de TEA (25 mM), uma ds quais incluía tolbutamida que é um inibidor dos canais de KATP. Os sinais obtidos na presença deste composto tinham menor amplitude, de acordo com a ideia que a depressão observada é, pelo menos em parte, mediada pelos canais de KATP. Na última parte do trabalho (Parte V), compararam-se variações de autofluorescência associadas com flavoproteínas, induzidas por KCl (20 mM) e TEA (25 mM), com as obtidas de fatias incubadas com NG. Os dois compostos despolarizantes, originaram sinais opostos de autofluorescênica variáveis no tempo, potenciados no caso de KCl e inibidos por TEA, tal como se verificou para os sinais de zinco, sugerindo a existência de de uma relação próxima entre as variações de autofluorescência e de zinco. As medições efetuadas em fatias contendo NG incluem uma componente de autofluorescência variável no tempo e uma componente de zinco-NG. Nas condições experimentais usadas considera-se que a primeira componente tem origem em flavoproteínas, refletindo níveis de FAD e o estado metabólico redox das mitocôndrias. O sinal real de zinco foi obtido subtraindo, ponto por ponto, a autofluorescência dos sinais de fluorescência total. Na presença de tolbutamida as variações de zinco calculadas são muito reduzidas em relação às obtidas sem o bloqueador. Este facto está de acordo com a ideia que, nas sinapses das fibras musgosas do hipocampo, a ação do zinco mediada pelos canais de KATP, contribui para o papel neuroprotetor do zinco em condições de estimulação sináptica intensa.
Description: Tese de Doutoramento em Engenharia Biomédica, apresentada ao Departamento de Física da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/87491
Rights: embargoedAccess
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