Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/87472
Title: β-glucan-based adjuvants for Hepatitis B vaccination: particulate design for prophylactic and therapeutic needs
Authors: Soares, Edna Filipa Pais
Orientador: Faneca, Henrique
Borges, Olga
Keywords: polymeric particles; adjuvants; vaccines; β-glucan; chitosan; oral vaccine; DNA vaccine; hepatitis B virus; hepatitis B antigen; partículas poliméricas; adjuvantes; vacinas; β-glucano; quitosano; vacina oral; vacina de DNA; vírus da hepatite B; antigénio da hepatite B
Issue Date: 11-Sep-2018
Project: CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020 
PROSAFE/0001/2016 
Projeto UID/NEU/ 04539/2013 
SFRH/BD/96167/2013 
Abstract: The hepatitis B virus (HBV) killed 887 000 people in 2015. The World Health Organization (WHO) set the goal to eliminate HBV as a public health threat by 2030. The major hurdles include the high prevalence in developing countries due to limited vaccination coverage and mother-to-child transmission and, the ineffective HBV clearance from hepatocytes with currently available antivirals. Hence, therapeutic vaccines may stimulate both the neonate immature or the chronic hepatitis B exhausted immune systems, to either avoid HBV persistence or promote HBV clearance. Additionally, new vaccines can be designed to provide the antigen with increased stability to temperature variations, benefiting HBV vaccine coverage in developing countries, where the cold chain to vaccine transportation is not readily available. Thus, this thesis aimed to develop new powerful adjuvants to include in new vaccines to meet hepatitis B current needs. β-glucan particles were elected to mimic pathogen three-dimensional structure and chemical composition. The capacity to induce HBsAg-specific Th1 antiviral protection through several vaccination strategies was the main goal. Indeed, this was the first time that nonmodified natural β-glucans were used as adjuvants for HBsAg. The new formulations of HBsAg vaccines were tested through subcutaneous (SC) and oral routes, while plasmid DNA (pDNA) vaccines only through the SC route. Different β-glucan adjuvants were developed and included β-glucan particles (GPs), prepared from alkaline/acid treatment of Saccharomyces cerevisiae, β-glucan/chitosan particles (GenGluChiPs), prepared by a precipitation technique followed by genipin crosslink and, polyplexes prepared by pDNA complexation with cationic PβAE and PDMAEMA polymers (Pol) in the presence of β-glucan (GluPol) or combined with GPs (GPsPol). Notably, GenGluChiPs were produced by a new precipitation technique to combine two polymers that do not interact with each other. GPs were tested in all vaccination schedules while GenGluChiPs only for HBsAg SC vaccination and GluPol only for pDNA SC vaccination. Additionally, chitosan particles were developed for comparison purposes either by precipitation/coacervation (ChiPs) or precipitation followed by genipin crosslink (GenChiPs). Both were positively charged and had a mean diameter near 900 nm.GenGluChiPs, also positively charged, measured approximately 1.3 μm. On the other side, alginate coated ChiPs (AlgChiPs), used for oral vaccination, were negatively charged and had a mean diameter close to 1.5 μm. GPs were electrically neutral and measured between 2 μm and 4 μm. Pol and GluPol were highly positive with a mean diameter of 180 nm. Regarding the oral vaccination study (Chapter 2), although both AlgChiPs and GPs were efficiently internalized by intestinal Peyer’s patches, the oral vaccination schedule resulted in 60 % mice seroconversion, easily surpassed by a SC priming prior the oral boosts. The presence of HBsAg-specific IgA on mucosal surfaces and IFN-γ in the liver were the major advantages found. Interestingly, in vitro studies showed that only ChiPs were able to induce mast cell activation, evaluated by cell degranulation and β- hexosaminidase release. Concerning pDNA vaccination study (Chapter 3), although the excellent Pol transfection results, further enhanced by the combination with GPs (GPsPol) in fibroblast and macrophage cell lines, the SC vaccination either with Pol, GluPol or GPsPol resulted in only 40 % seroconversion and low antibody titers. The mechanistic study with GenChiPs, GenGluChiPs and GPs showed that the increased TNF-α secretion from mice spleen cells was associated to β-glucan (GenGluChiPs and GPs), while RANTES secretion was associated to chitosan (GenChiPs and GenGluChiPs), suggesting an immunological advantage of the newly developed GenGluChiPs. However, in the human monocyte study, the TNF-α production was consistently observed for all the particles. The mice immunization study with HBsAg to validate GenGluChiPs adjuvant (Chapter 4) showed high serum anti-HBsAg IgG, mostly subtype IgG1 followed by IgG3. No signs of cell-mediated immunity were found after two vaccine doses. However, in another study with three vaccine doses (Chapter 5), the GPs adjuvant induced a strong and varied HBsAg-specific cell-mediated immunity observed by the secretion of cytokines related with Th1, Th2, Th17, Th22 and Treg-biased immune responses. For the first time, these studies allowed the validation of GPs as great adjuvant to include in HBsAg vaccines, also revealing a therapeutic value against viral infections. Overall, the work herein developed and described represents an important contribution to the knowledge of both β-glucan and chitosan/β-glucan particle adjuvant mechanisms, with a great impact for future studies.
O vírus da hepatite B (HBV) originou 887 000 mortes em 2015. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estabeleceu o objetivo de eliminar o HBV como uma ameaça de saúde pública até 2030. Os principais problemas incluem a elevada prevalência nos países em vias de desenvolvimento devido à ineficiente cobertura de vacinação e elevada transmissão mãe-filho, e a dificuldade em eliminar o HBV dos hepatócitos com as terapias antivirais disponíveis. A nova geração de vacinas deverá ter em conta tanto o sistema imunitário imaturo dos recém-nascidos como a exaustão do sistema imunitário dos portadores crónicos. Além disso, novas vacinas podem promover a estabilidade do antigénio perante variações de temperatura, frequente nos países em vias de desenvolvimento, onde cadeias de transporte adequadas são ainda escassas. Nesse sentido, esta tese teve como objetivo desenvolver novos e poderosos adjuvantes para incluir em novas vacinas, de modo a ir ao encontro das necessidades de controlo da hepatite B. Partículas à base de β-glucano foram selecionadas por simularem as propriedades químicas e tridimensionais dos patogénios. O objetivo principal foi desenvolver uma vacina com a capacidade de induzir uma resposta celular específica para o HBsAg, e para isso foram desenvolvidas e testadas várias estratégias. Curiosamente, esta foi a primeira vez que β-glucanos naturais não modificados foram usados como adjuvante para o HBsAg. Vacinas com o HBsAg foram testadas pelas vias subcutânea (SC) e oral, e vacinas com o plasmídeo (pDNA) foram testadas pela via SC. Foram desenvolvidos vários adjuvantes compostos por β-glucano, tais como partículas de β-glucano (GPs) preparadas por tratamento ácido/alcalino da Saccharomyces cerevisiae, partículas de β- glucano/chitosano (GenGluChiPs) produzidas por um método de precipitação/reticulação com genipina e poliplexos preparados por complexação do pDNA com os polímeros catiónicos PβAE e PDMAEMA (Pol) na presença de β-glucano (GluPol) ou posteriormente combinados com as GPs (GPsPol). Notavelmente, as GenGluChiPs foram produzidas por um método inovador para a combinação de dois polímeros que não interagem entre si. As GPs foram testadas em todas as estratégias de vacinação, enquanto que as GenGluChiPs foram apenas testadas pela via SC com o HBsAg e os GluPol pela via SC com o pDNA. Partículas de quitosano foram desenvolvidas tanto por precipitação (ChiPs) como por precipitação/reticulação (GenChiPs), como termo de comparação. Ambas apresentaram carga positiva e um diâmetro médio de 900 nm. As GenGluChiPs, também positivas, mediam cerca de 1,3 μm. Por outro lado, ChiPs revestidas com alginato (AlgChiPs) para vacinação oral apresentaram carga negativa e um tamanho médio de 1,5 μm. As GPs, neutras, possuíam um tamanho entre 2 μm e 4 μm. Os Pol e os GluPol apresentaram uma carga fortemente positiva e um diâmetro médio de 180 nm. Quanto ao estudo de vacinação oral (Capítulo 2), apesar de as AlgChiPs e as GPs terem sido internalizadas pelas placas de Peyer do intestino de murganhos, três doses pela via oral resultaram em apenas 60 % de eficácia, enquanto que a presença de um priming pela via SC levou a 100 % de eficácia. O mais interessante, não observado pela via SC, foi a indução de anti-HBsAg IgA nas mucosas e aumento de IFN-γ no fígado. Curiosamente, apenas as ChiPs ativaram uma linha celular de mastócitos, verificado pela desgranulação e libertação de β-hexosaminidase. Quanto ao estudo de vacinação com o pDNA (Capítulo 3), apesar da excelente transfecção dos Pol, aumentada na presença de GPs (GPsPol) em fibroblastos e em macrófagos, a vacinação pela via SC resultou em apenas 40 % de eficácia e baixos títulos de anticorpos para todas as formulações (Pol, GluPol e GPsPol). Nos estudos mecanísticos, o aumento da secreção de TNF-α em células do baço de murganhos foi associada com o β-glucano (GenGluChiPs and GPs) e a secreção de RANTES com o quitosano (GenChiPs e GenGluChiPs), sugerindo uma vantagem para as GenGluChiPs aqui desenvolvidas. Por outro lado, o aumento da produção de TNF-α em monócitos humanos, foi observada após a incubação com os três tipos de partículas. A vacinação pela via SC para a validação da GenGluChiPs como adjuvante (Capítulo 4) levou ao aumento de IgG específica para o HBsAg no soro de murganhos, maioritariamente do subtipo IgG1 e também IgG3. As duas doses da vacina mostraram-se ineficazes na indução da resposta celular. Por outro lado, num segundo estudo com três doses da vacina (Capítulo 5), apenas as GPs levaram numa elevada e ampla secreção de citocinas relacionadas com respostas Th1, Th2, Th17, Th22 e Treg, específica para o HBsAg. Pela primeira vez, este estudo consagrou o valor de incluir as GPs em vacinas com o HBsAg, bem como o seu potencial terapêutico para estas infeções virais. No geral, o trabalho desenvolvido providenciou uma importante contribuição para o conhecimento do mecanismo adjuvante de partículas de β-glucano e β- glucano/quitosano, relevante para estudos futuros.
Description: Tese de Doutoramento em Ciências Farmacêuticas, no ramo de Tecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/87472
Rights: embargoedAccess
Appears in Collections:FFUC- Teses de Doutoramento

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