Unveiling the role of miRNAs in synaptic plasticity

Abstract

As redes neuronais estão constantemente a adaptar a densidade sináptica e a eficiência da transmissão sináptica em resposta ao normal desenvolvimento neuronal e a processos de aprendizagem. Formas de plasticidade Hebbiana, co mo a potenciação de longo termo ( LTP ) e depressão de longo termo ( LTD ) , são consideradas as fundações celulares da aprendizagem e memória. Estas formas de plasticidade têm como base um mecanismo de feedback positivo que facilita o reforço das conexões sinápticas específicas. Contudo, se não forem regulados, estes mecanismos podem promover uma diminuição do limiar de atividade necessário para indução de LTP/LTD, conduzindo a eventos extremos de hiperexcitabilidade ou eliminação sináptica. Mecanismos homeostáticos, como o escalamento sináptico, previnem esse tipo de situações, atuando como uma resposta compensatória de feedback negativo que mantém a estabilidade das redes neuronais. No escalamento sináptico, os neurónio s detetam níveis de atividade globais, através da despolarização da membrana e do influxo de cálcio, promovendo o escalamento da sua força sináptica ao ajustarem os níveis sinápticos de recetores AMPA. Muitos dos componentes associados à maquinaria que pro move o escalamento das sinapses estão identificados, contudo ainda falta compreender de que forma estes mecanismos promovem a regulação da resposta neuronal. A janela temporal do escalamento das sinapses sugere a implicação de alterações nos programas de t ranscrição e pós - transcrição nestes processos; porém, estes programas estão pouco caracterizados. De facto, vários paradigmas de escalamento sináptico requerem síntese proteica local para promoverem rapidamente alterações funcionais necessárias para a indução de escalamento sináptico. Os microRNAs (miRNAs) desempenham um papel fundamental como reguladores pós - transcrição da síntese proteica local: um miRNA pode regular múltiplos transcritos e a expressão dos miRNAs é rapidamente alterada por atividade n euronal. Até agora, os miRNAs têm sido implicados em vários processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento neuronal e plasticidade sináptica. Contudo, poucos miRNAs têm sido associados com mecanismos de escalamento sináptico. No presente estuo, observám os que o bloqueio crónico de recetores AMPA e NMDA induz escalamento sináptico positivo das correntes pós - sinápticas excitatórias mediadas por recetores AMPA e aumenta o conteúdo sináptico de GluA1 e GluA2. Além disso, este paradigma de bloqueio de ativida de afeta o transcriptoma neuronal, afetando particularmente os níveis de transcritos associados com processos de desenvolvimento neuronal e plasticidade sináptica, incluindo vários transcritos associados previamente com o escalamento sináptico, como Arc , B dnf , CamKII β , Plk2 , Rps6ka1 , entre outros. O perfil neuronal de miRNAs também é regulado por mecanismos de escalamento sináptico . A expressão do miR - 186 - 5p é muito afetada, estando consideravelmente diminuída de forma persistente após 2h de bloqueio iv crónic o de atividade sináptica. Adicionalmente, inibição basal do miR - 186 - 5p impede o escalamento sináptico da amplitude das correntes mediadas por recetores AMPA. O miR - 186 - 5p regula a expressão endógena de GluA2 em condições fisiológicas, através de um local - a lvo localizado na 3’UTR do Gria2 . Para além disso, supressão da atividade sináptica leva ao aumento da expressão de GluA2 através de mecanismos dependentes da região 3’UTR do Gria2 . Inibição do miR - 186 - 5p impede o escalamento positivo dos níveis totais e s inápticos de GluA2 em condições de bloqueio de atividade, de acordo com os estudos de electrofisiologia que mostram que inibição do miR - 186 - 5p impede o escalamento sináptico. Tendo em conta padrão de expressão do miR - 186 - 5p ao longo do desenvolvimento, e a previsão de alvos do miR - 186 - 5p que codificam proteínas com uma função no desenvolvimento dendrítico e sináptico, avaliámos o seu envolvimento no desenvolvimento neuronal. Reportamos que o miR - 186 - 5p não está envolvido na fase final do desenvolvimento de ndrítico mas promove a maturação das espículas dendríticas. Além disso, testámos o papel do mirR - 186 - 5p na formação e/ou manutenção das sinapses excitatórias e inibitórias através da análise das respetivas proteínas pós - sinápticas, PSD95 e gefirina. Demons trámos que a expressão do miR - 186 - 5p promove um aumento da densidade de sinapses excitatórias e no conteúdo sináptico de PSD95, enquanto reduz os níveis de gefirina. Estes resultados indicam que o miR - 186 - 5p regula a balanço sináptico entre excitação e ini bição (E/I) hipocampo. Globalmente, os nosso resultados implicam o miR - 186 - 5p em processos homeostáticos de escalamento sináptico, na regulação da expressão de GluA2 e na coordenação do rácio neuronal de E/I, sugerindo que o miR - 186 - 5p desempenha um impor tante papel no desenvolvimento cerebral e em respostas homeostáticas cerebrais a estímulos internos e externos.

Neuronal networks are constantly adapting their synapse number and strength in response to developmental or learning-related processes. Hebbian forms of plasticity, such as long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD), are thought to be the cellular counterpart of learning and memory. These forms of plasticity rely on positive feedback mechanisms to facilitate the reinforcement of specific synaptic connections. However, if left unchecked, these mechanisms could decrease the threshold for LTP/LTD induction, leading to runaway excitation or synapse elimination. Homeostatic mechanisms, such as synaptic scaling, prevent extreme activity levels, acting as a compensatory negative-feedback response to maintain the stability of neuronal function. In synaptic scaling, neurons perceive their overall levels of activity through depolarization and calcium influx, and scale their synaptic strength accordingly by adjusting synaptic AMPA receptor levels. Many components of the synaptic scaling apparatus have been identified but full understanding of how synaptic scaling mechanisms work to regulate neuronal response is still lacking. The time window of synaptic scaling suggests that transcriptional and post-transcriptional programs may be activated upon chronic changes in neuronal activity, but these programs are poorly characterized. In fact several synaptic scaling paradigms require local protein synthesis to rapidly promote the functional modifications needed for synaptic scaling induction. microRNAs (miRNAs) play a pivotal role as posttranscriptional regulators of local protein synthesis: a single miRNA can target multiple transcripts and their expression is rapidly regulated by neuronal activity. So far, miRNAs have been implicated in several physiological processes, including neuronal development and synaptic plasticity. However, few miRNAs have been implicated in synaptic scaling mechanisms. In this present work, we report that chronic blockade of excitatory synaptic activity induces synaptic upscaling of AMPA receptor-mediated mini excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) and increases the synaptic content of GluA1 and GluA2 AMPA receptor subunits. Moreover, this paradigm of activity blockade affects the neuronal transcriptome, impacting on the levels of transcripts associated with neuronal development and synaptic plasticity processes, including several transcripts previously associated with synaptic scaling, such as Arc, Bdnf, CamKIIβ, Plk2, Rps6ka1, among others. The neuronal miRNA profile is also regulated by synaptic scaling mechanisms. The expression of miR-186-5p is highly affected, being persistently downregulated starting at 2h of blockade of synaptic activity. Additionally, inhibition of miR-186-5p hampers upscaling of the amplitude of AMPA receptor-mediated mEPSCs upon synaptic activity suppression. Notably, we found that miR-186-5p is a regulator of endogenous GluA2 expression under physiological conditions, through a targeting site located in the Gria2 3’UTR. In fact, increased GluA2 expression is triggered by prolonged suppression of synaptic activity, in a manner dependent on regulatory elements located on the Gria2 3’ untranslated region (UTR). Long-term inhibition of miR-186-5p blocked upscaling of total and synaptic GluA2 content upon synaptic activity blockade, in agreement with electrophysiological studies showing that inhibition of miR-186-5p hampers synaptic scaling. Given the developmental expression pattern of miR-186-5p, and predictions suggesting that it targets transcripts encoding proteins with a role in dendritic and synaptic development, we tested its implication in neuronal development and synapse formation/maintenance. We report that miR-186-5p is not involved in late dendritic development but it promotes dendritic spine maturation. Further, we evaluated how miR-186-5p impacts on excitatory and inhibitory synapses by analysing their respective postsynaptic proteins, PSD95 and gephyrin. We show that expression of miR-186-5p promotes an increase in excitatory synapse density and synaptic PSD95 content, while reducing the levels of gephyrin. These results indicate that miR-186-5p regulates the excitatory/inhibitory (E/I) synaptic balance in the hippocampus. Overall, our results implicate miR-186-5p in homeostatic synaptic scaling processes, in the regulation of GluA2 expression and in the coordination of the neuronal E/I ratio, suggesting that miR-186-5p has an important role in brain development and in brain homeostatic responses to internal and external stimuli.