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Title: Layer-by-Layer nanoparticles designed to improve the bioavailability of resveratrol
Authors: Santos, Ana Cláudia Paiva 
Orientador: Ribeiro, António
Veiga, Francisco
Fontes Ribeiro, Carlos
Keywords: Resveratrol; Nanotechnology; Nanoparticle; Layer-by-Layer self-assembly; Electrostatic interactions; Washless approach; Controlled drug release; Bioavailability; Oral delivery; Wistar rat; Pharmacokinetics; nanotecnologia; nanopartícula; auto-montagem camada-a-camada; interações eletroestáticas; abordagem sem lavagens; libertação controlada de fármacos; biodisponibilidade; farmacocinética; administração oral; rato Wistar
Issue Date: 25-Jan-2018
Citation: SANTOS, Ana Cláudia Paiva - Layer-by-layer nanoparticles designed to improve the bioavailability of resveratrol. Coimbra : [s.n.], 2018. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/44558
Abstract: Resveratrol (RSV) has been one of the most and extensively investigated polyphenols in the last recent years, owing to its broad-spectrum of promising therapeutic activities. It is extremely attractive for prevention or therapy where a magnitude of pathophysiological pathways is affected, making it a promising molecule for fighting cancer, diabetes and neurodegenerative diseases, amongst other targets. However, its therapeutic potential is strongly limited by its physicochemical properties, mainly its low aqueous solubility and stability, and its poor pharmacokinetics profile, which seriously compromise its oral bioavailability. RSV formulations, mainly available as nutritional supplements, are classic pharmaceutical dosage forms such as powders, tablets and hard gelatin capsules, to be administrated by the oral route. These formulations are often produced under uncontrolled processing procedures and using RSV with uncontrolled origin, which have shown to be not efficient. To achieve an optimal response of RSV, new strategies are required to enhance its bioavailability and reduce its perceived toxicity. New delivery systems are sought out as valid alternatives to circumvent the limitations of the physicochemical characteristics and pharmacokinetics of RSV. An alternative formulation strategy to tackle this challenge includes the development of a safe and effective RSV formulation, using new drug delivery systems, among which nanotechnology assumes nowadays a prominent position. Layer-by-Layer (LbL) self-assembly is an emergent nanotechnology, which is based on the design of tunable onion-like multilayered nanoarchitectures, composed of oppositely charged polyelectrolytes (PEs), upon the surface of low soluble drug nanocores, as RSV. This nanotechnology affords a versatile control over key formulation parameters, which are able to ultimately promote an improved pharmacokinetics profile. Facing these potentialities, in this work we aim the development of RSV-loaded LbL nanoformulations capable of improving the bioavailability of this Biopharmaceutics Classification System (BCS) class II drug, by using Wistar rats as the animal model. The research work of this thesis started with the development of a top-down LbL technique using a washless approach aiming the nanoencapsulation of ibuprofen (IBF), which was used in this stage of the work as a model BCS class II drug. For each saturated layer deposition, PE concentration was assessed by the design of PE titration curves. The LbL nanoshells were constituted by the PEs pair cationic polyallylamine hydrochloride (PAH)/anionic polystyrene sulfonate (PSS), up to the achievement of 2.5, 5.5 and 7.5 PE bilayers. IBF LbL nanoparticles (NPs) covered with 7.5 PAH/PSS bilayers evidenced to be stable aqueous nanocolloids of this model drug, as well as biocompatible. Moreover, a controlled release of IBF from LbL NPs was accomplished under simulated intestinal conditions (from 5 h up to 7 days), according to the number of coating bilayers, which attributed to these structures the capacity to improve biopharmaceutical parameters of BCS class II drugs, as RSV. Considering the knowledge acquired in the development of the aforementioned LbL NPs, novel LbL NPs were performed towards the nanoencapsulation of RSV. In this work, RSV nanoprecipitation followed by LbL self-assembly of PE, using a washless approach, was performed by applying the PE pair cationic PAH/anionic dextran sulfate (DS), by tracing, likewise, titration curves. Aqueous RSV nanocores and RSV LbL nanoformulations with a 2.5 (RSV-(PAH/DS)2.5 NPs), 5.5 (RSV-(PAH/DS)5.5 NPs) and 7.5 (RSV-(PAH/DS)7.5 NPs) bilayers were developed for the first time. Homogenous particle size distributions at the desired nanoscale interval, good colloidal and chemical stabilizations, high encapsulation efficiency, along with an excellent biocompatibility were verified. Those LbL NPs promoted a controlled release of RSV dependently of the number of PE bilayers under simulated gastrointestinal conditions, particularly in the intestine medium, which greatly highlighted their biopharmaceutical advantage. Our findings evidently pointed out that LbL PAH/DS-based NPs constitute a rational strategy for the oral administration of RSV in vivo. Lastly, the bioavailability of the LbL nanoformulation composed of 5.5 bilayers of PAH and DS, previously developed, was performed using Wistar rats. We investigated the bioavailability of this LbL nanoformulation in comparison to the respective nanoformulation without LbL coatings (RSV nanocores) and the free RSV suspension, by pharmacokinetic studies following oral dosing to Wistar rats (20 mg/kg). For this study, due to the key role of the bioanalytical method in the in vivo data acquisition, a rapid, selective, and sensitive HPLC–DAD method has been successfully optimized and fully validated to confidently quantify RSV levels in rat plasma matrix, together with the optimization of the sample preparation procedure. Moreover, the chemical stability of RSV was assured for 24 h in simulated gastric and intestinal fluids with enzymes. Concerning the pharmacokinetic study, besides some weaknesses have been identified regarding the behaviour of the LbL shell after oral administration in Wistar rats, our results fully demonstrated, for the first time, that LbL NPs significantly enhanced the systemic exposure of RSV. Such data emphasized thus the biopharmaceutical advantage of LbL NPs over the free drug, suggesting them as a potential oral drug delivery system for RSV. In conclusion, with this research work we present evidence that RSV nanoencapsulation by LbL self-assembly nanotechnology constitutes a promising strategy to enhance the bioavailability of RSV after oral administration, offering great prospective to enlarge its potential preventive and therapeutic applications.
O resveratrol (RSV) tem sido um dos polifenois que nos últimos anos mais foi investigado devido ao seu alargado potencial terapêutico. É extremamente interessante na prevenção e terapia, quando várias vias fisiopatológicas são afetadas, tornando-a uma molécula promissora para combater, entre outras patologias, o cancro, a diabetes e as doenças neurodegenerativas. Contudo, o seu potencial terapêutico é fortemente limitado pelas suas propriedades físico-químicas, sobretudo a sua baixa solubilidade aquosa e estabilidade, bem como pelo seu perfil farmacocinético fraco, que comprometem gravemente a sua biodisponibilidade oral. As formulações de RSV, disponíveis principalmente sob a forma de suplementos nutricionais, são formas farmacêuticas clássicas, tais como pós, comprimidos e cápsulas de gelatina dura, que se destinam a ser administrados pela via oral. Estas formas farmacêuticas são frequentemente produzidas através de procedimentos de fabrico sem controlo de qualidade e com RSV de origem não controlada, o que compromete a sua eficácia. Por forma a obter uma resposta ótima ao RSV, são necessárias novas estratégias para aumentar a sua biodisponibilidade e reduzir a sua toxicidade. Novos sistemas de libertação são necessários como alternativas válidas para ultrapassar as limitações inerentes às características físico-químicas e farmacocinéticas do RSV. Uma estratégia de formulação alternativa para responder a esse desafio inclui o desenvolvimento de uma formulação de RSV segura e eficaz, utilizando novos sistemas de libertação, entre os quais a nanotecnologia assume atualmente uma posição proeminente. A “auto-montagem por camada-a-camada” (LbL) é uma nanotecnologia emergente, que se baseia na conceção de nanoarquitecturas em multicamadas reguláveis, semelhantes à estrutura de uma cebola, compostas por polielectrólitos (PEs) carregados com cargas opostas, sob a superfície de nanonúcleos de fármacos de baixa solubilidade, como o RSV. Esta nanotecnologia oferece um controlo versátil sobre os principais parâmetros de formulação, que são capazes de, em última instância, melhorar o perfil farmacocinético. Face a estas potencialidades, com este trabalho pretende-se o desenvolvimento de nanoformulações de LbL carregadas com RSV capazes de melhorar a biodisponibilidade deste fármaco da classe II do Sistema de Classificação Biofarmacêutica (BCS), usando ratos Wistar como modelo animal. O trabalho de investigação desta tese começou pelo desenvolvimento de uma técnica de LbL, sob a vertente “top-down”, realizada usando uma abordagem sem lavagens que visou a nanoencapsulação de ibuprofeno (IBF), fármaco que foi usado nesta fase do trabalho como um fármaco modelo da classe II do BCS. Para cada deposição de camada saturada, a concentração de PE foi avaliada pela conceção de curvas de titulação de PEs. As nanocápsulas de LbL foram constituídas pelo par de PEs catiónico cloridrato de polialilamina (PAH) / aniónico poliestireno sulfonato (PSS), até à deposição de 2.5 (IBF-(PAH/PSS)2.5NPs), 5.5 (IBF-(PAH/PSS)5.5NPs) e 7.5 (IBF-(PAH/PSS)7.5NPs) bicamadas de PEs. As nanopartículas (NPs) de LbL de IBF revestidas com 7.5 bicamadas de PAH/PSS evidenciaram ser nanocolóides aquosos estáveis deste fármaco modelo, bem como serem biocompatíveis. Além disso, uma libertação controlada do IBF das NPs de LbL foi conseguida sob condições intestinais simuladas (de 5 h até 7 dias), de acordo com o número de bicamadas de revestimento, atribuindo a essas estruturas a capacidade de melhorar os parâmetros biofarmacêuticos de fármacos da classe II do BCS, como o RSV. Considerando o conhecimento adquirido aquando do desenvolvimento das NPs anteriormente referidas, novas NPs de LbL foram concebidas com vista à nanoencapsulação de RSV. Nesta fase do trabalho, a nanoprecipitação de RSV seguida de LbL de PEs, usando a abordagem sem lavagens, foi realizada aplicando o PE catiónico PAH / PE aniónico sulfato de dextrano (DS), pelo desenho, da mesma forma, de curvas de titulação. Os nanonúcleos de RSV aquosos e as nanoformulações de LbL de RSV com 2.5 (RSV-(PAH/DS)2.5NPs), 5.5 (RSV-(PAH/DS)5.5NPs) e 7.5 (RSV-(PAH/DS)7.5NPs) bicamadas foram desenvolvidos pela primeira vez. Verificou-se a obtenção de distribuições homogéneas de tamanho de partícula no intervalo da nanoescala desejado, boa estabilização coloidal e química, elevada eficiência de encapsulação, juntamente com uma excelente biocompatibilidade. Estas NPs de LbL promoveram uma libertação controlada do RSV, que mostrou ser dependente do número de bicamadas de PEs sob condições gastrointestinais simuladas, particularmente no meio intestinal, evidenciando fortemente a sua vantagem biofarmacêutica. Os nossos resultados apontaram, de forma evidente, que as NPs de LbL formadas por PAH/DS constituem uma estratégia racional para a administração oral de RSV in vivo. Por fim, a biodisponibilidade da nanoformulação de LbL composta por 5.5 bicamadas de PAH e DS, desenvolvida anteriormente, foi realizada em ratos Wistar. A biodisponibilidade dessas nanoformulação de LbL foi investigada, em comparação com a respetiva nanoformulação sem revestimentos de LbL (nanonúcleos de RSV) e a suspensão de RSV livre, através de estudos farmacocinéticos após administração oral das nanoformulações a ratos Wistar (20 mg/kg). Para este estudo, devido ao papel fundamental do método bioanalítico na aquisição de dados referentes ao ensaio in vivo, um método HPLC-DAD rápido, seletivo e sensível foi otimizado com sucesso e totalmente validado para quantificar com rigor os níveis de RSV na matriz de plasma de rato, juntamente com a otimização do procedimento de preparação da amostra. Além disso, a estabilidade química do RSV foi assegurada durante 24 h em fluidos gástrico e intestinal simulados contendo enzimas. No que diz respeito ao estudo farmacocinético, apesar de terem sido identificados alguns pontos fracos quanto ao comportamento do revestimento de LbL após a administração oral em ratos Wistar, os nossos resultados demonstraram, pela primeira vez, que as NPs de LbL aumentaram significativamente a exposição sistémica do RSV. Tais dados enfatizaram, portanto, a vantagem biofarmacêutica das NPs de LbL sobre o fármaco livre, sugerindo-as como um potencial sistema de libertação oral para RSV. Em conclusão, com este trabalho de investigação, apresentamos evidências de que a nanoencapsulação do RSV pela nanotecnologia de LbL constitui uma estratégia promissora para aumentar a biodisponibilidade do RSV após a administração oral, oferecendo excelente potencial para aumentar as suas potenciais aplicações preventivas e terapêuticas.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Tecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/44558
Rights: embargoedAccess (18 months)
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