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Title: A Screening Strategy for Evaluation of Drug Transport across the Blood-Brain Barrier: Application to Catechol-O-methyltransferase Inhibitors, Dopamine β-hydroxylase Inhibitors and Dibenz[b,f]azepine-5-carboxamide Derivatives
Authors: Aparício, Joana Bicker de Melo Alves 
Orientador: Falcão, Amílcar
Alves, Gilberto
Keywords: Blood-brain barrier; Bioanalysis; Catechol-O-methyltransferase inhibitors; Central nervous system; Dibenz[b,f]azepine-5-carboxamide derivatives; Dopamine β-hydroxylase inhibitors; Pharmacokinetics
Issue Date: 30-Jan-2018
Citation: APARÍCIO, Joana Bicker de Melo Alves - A Screening strategy for evaluation of drug transport across the blood-brain barrier : application to catechol-o-methyltransferase Inhibitors, dopamine β-hydroxylase Inhibitors and dibenz[b,f]azepine-5-carboxamide derivatives. Coimbra : [s.n.], 2018. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/42543
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/78256/2011/PT 
Abstract: Despite the increasing incidence of central nervous system (CNS) diseases worldwide, there are several unmet clinical needs and a generalized failure in the discovery and development of innovative drugs to treat them. Indeed, the difficulty is such that several pharmaceutical companies are decreasing the investment made in this therapeutic area or even retreating completely from the field, in spite of the commercial opportunities that exist. This may aggravate and delay the development of much needed CNS drugs for the patients. Among the reasons for the lack of success are inconclusive pharmacokinetic data, due to misconceptions in the parameters used to describe and orientate brain penetration, as well as, insufficient exposure of the CNS to potential drugs because of the blood-brain barrier (BBB). Consequently, understanding the mechanisms that guide a compound into and out of the CNS is essential to improve CNS disease treatment and invert current trends. This evaluation also extends to peripherally-active drugs in order to reduce unwanted and potentially adverse CNS effects. The rate, extent and intra-brain distribution are fundamental concepts to evaluate and select compounds during drug discovery and development programs. Given that the BBB is a highly complex and dynamic structure, it is not yet possible to completely recreate all of its features in a single laboratory model. Thus, to overcome this obstacle, it was decided that associating distinct models that encompass individual aspects of CNS penetration and combining the obtained data, would be a feasible approach. The general purpose of the present thesis was to implement a screening strategy to characterize the passage of compounds across the BBB. This implied the optimization and validation of several experimental methods, including the parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), cell-based assays and in vivo studies. The project began with the establishment of a PAMPA-BBB model using an in-house brain lipid extract. This method was applied to a set of test compounds, composed by catechol-O-methyltransferase inhibitors (BIA 9-1059, BIA 9-1079, entacapone, nebicapone, opicapone, tolcapone), dopamine β-hydroxylase inhibitors (etamicastat, nepicastat, zamicastat) and dibenz[b,f]azepine-5-carboxamide derivatives (eslicarbazepine acetate, S-licarbazepine). It demonstrated discriminatory capacity between less and more permeable BBB compounds, as well as, physicochemical selectivity. In the subsequent stage of work, priority was given to catechol-O-methyltransferase and dopamine β-hydroxylase inhibitors. Cell-based assays were performed to identify P-glycoprotein (P-gp) and breast cancer resistance protein (BCRP) inhibitors and/or substrates, since P-gp and BCRP are the two main efflux transporters of the BBB. Intracellular accumulation assays enabled the detection of concentration-dependent P-gp inhibitors (zamicastat) or BCRP inhibitors (BIA 9-1079, nebicapone, tolcapone, etamicastat, nepicastat, zamicastat). In bidirectional transport assays, three P-gp substrates (BIA 9-1079, etamicastat, nepicastat) and five BCRP substrates (BIA 9-1059, entacapone, nebicapone, opicapone, etamicastat) were identified. This required the previous validation of high performance liquid chromatography (HPLC) techniques for compound quantification. Lastly, the extent of BBB penetration, given by the unbound ratio of brain-to- plasma concentrations (Kp,uu), was estimated during in vivo studies with Wistar rats for the catechol-O-methyltransferase inhibitors, BIA 9-1079 and tolcapone, applying validated HPLC techniques in plasma and brain homogenate. In order to determine the unbound fractions of BIA 9-1079 and tolcapone in plasma and brain homogenate, an ultrafiltration assay was applied. Intra-brain distribution was evaluated through the volume of distribution of unbound drug in the brain and the unbound drug intracellular-to-extracellular partitioning coefficient. Kp,uu was below unity for both compounds, revealing a limited extent of brain penetration, particularly for BIA 9-1079, and the occurrence of efflux. This was confirmed through a significant increase of brain concentrations following the co-administration of a P-gp and BCRP inhibitor, elacridar. Considering the obtained data, it can be concluded that the implemented strategy provides reliable information on the access of compounds to the CNS and that it can be applied in the future for the assessment of centrally-active compounds or other molecules intended for peripheral targets.
Apesar do aumento da incidência de patologias do sistema nervoso central (SNC) a nível mundial, existem ainda várias necessidades terapêuticas a colmatar, bem como, uma falha generalizada na descoberta e desenvolvimento de fármacos inovadores para o tratamento dessas mesmas doenças. De facto, a dificuldade é tal que várias empresas do setor farmacêutico estão a diminuir ou a evitar por completo o investimento nesta área terapêutica, apesar das oportunidades comerciais existentes. Por sua vez, isso poderá contribuir para o agravamento e atraso do desenvolvimento de fármacos para o SNC. Entre os motivos para a falta de sucesso incluem-se dados farmacocinéticos inconclusivos, devido a uma interpretação errónea dos parâmetros utilizados para descrever a passagem para o cérebro, e a exposição insuficiente do SNC a potenciais fármacos, atribuída à presença da barreira hematoencefálica (BHE). Consequentemente, a compreensão dos mecanismos que definem o transporte de um composto para o SNC é essencial para melhorar o tratamento de doenças cerebrais e reverter as atuais tendências. Esta avaliação também se estende a fármacos de ação periférica, de forma a minimizar efeitos centrais indesejados e potencialmente adversos. A velocidade, a extensão e a distribuição intra-cerebral são conceitos fundamentais para avaliar e selecionar compostos durante o processo de descoberta e desenvolvimento. Dado que a BHE é uma estrutura altamente complexa, não é ainda possível mimetizar todas as suas vertentes num só modelo laboratorial. Assim, considerou-se que a melhor abordagem seria associar modelos distintos que contemplam aspetos diferenciados da entrada no SNC e combinar a informação obtida. O objetivo global da presente tese consistiu em implementar uma estratégia de screening para caraterizar a passagem dos fármacos através da BHE. Isso implicou a otimização e validação de vários métodos experimentais, incluindo o ensaio de permeabilidade em membranas artificiais paralelas (PAMPA), ensaios celulares e estudos in vivo. O projeto teve início com um modelo de PAMPA, utilizando um extrato lipídico de cérebro obtido in-house. Este método foi aplicado a um conjunto de compostos teste, constituído por inibidores da catecol-O-metiltransferase (BIA 9-1059, BIA 9-1079, entacapone, nebicapone, opicapone, tolcapone), inibidores da dopamina β-hidroxilase (etamicastat, nepicastat, zamicastat) e derivados dibenz[b,f]azepina-5-carboxamida (acetato de eslicarbazepina, S-licarbazepina), tendo demonstrado capacidade discriminatória entre compostos menos e mais permeáveis através da BHE, assim como, seletividade físico-química. Na etapa seguinte do trabalho, foi dada prioridade a inibidores da catecol-O-metiltransferase e inibidores da dopamina β-hidroxilase. A realização de ensaios celulares permitiu identificar inibidores e/ou substratos de glicoproteína-P (P-gp) ou de breast cancer resistance protein (BCRP), considerados os principais transportadores de efluxo da BHE. Em ensaios de acumulação intracelular foi possível detetar inhibidores concentração-dependentes de P-gp (zamicastat) ou BCRP (BIA 9-1079, nebicapone, tolcapone, etamicastat, nepicastat, zamicastat), enquanto em ensaios de transporte bidirecional foram identificados três substratos de P-gp (BIA 9-1079, etamicastat, nepicastat) e cinco substratos de BCRP (BIA 9-1059, entacapone, nebicapone, opicapone, etamicastat). Para poder proceder à quantificação, efectuou-se uma validação de técnicas de cromatografia líquida de elevada eficiência (HPLC). A extensão de passagem através da BHE, dada pelo rácio de concentrações livres cérebro-plasma (Kp,uu), foi estimada durante estudos in vivo com ratos Wistar para dois inibidores da catecol-O-metiltransferase, BIA 9-1079 e tolcapone. Após a validação de técnicas de HPLC para a sua quantificação em plasma e cérebro, foi efetuado o ensaio de ultrafiltração para determinar as frações livres nessas mesmas matrizes biológicas. A distribuição intra-cerebral foi avaliada através do volume de distribuição de fármaco livre no cérebro e do coeficiente de partição intracelular-extracelular de fármaco livre. O valor de Kp,uu foi inferior à unidade para ambos os compostos, revelando uma exposição cerebral limitada, em especial para o BIA 9-1079. A ocorrência de efluxo foi confirmada após co-administração de um inibidor de P-gp e BCRP, elacridar, o qual levou a um aumento significativo das concentrações cerebrais dos dois compostos. Considerando os resultados obtidos, conclui-se que a estratégia implementada fornece informação fiável sobre o acesso dos compostos ao SNC e que poderá ser futuramente aplicada para a avaliação de compostos de ação central ou periférica.
Description: Tese de doutoramento em Ciências farmacêuticas, na especialidade de Farmacologia e Farmacoterapia, apresentada à Faculdade de farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/42543
Rights: embargoedAccess (18 months)
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