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Title: Brain-like endothelial cells derived from stem cells to study BBB development and targeting
Authors: Almeida, Catarina Oliveira Praça de 
Orientador: Ferreira, Lino
Dehouck, Marie-Pierre
Keywords: Barreira hemato-encefálica; Células estaminais; Células endoteliais cerebrais; Desenvolvimento da BHE; Permeação da BHE; Nanopartículas
Issue Date: 14-Feb-2017
Citation: ALMEIDA, Catarina Oliveira Praça de - Brain-like endothelial cells derived from stem cells to study BBB development and targeting. Coimbra : [s.n.], 2017. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/32374
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876/147358/PT 
info:eu-repo/grantAgreement/EC/FP7/307384/EU 
Abstract: A barreira hemato-encefálca (BHE) é uma estrutura complexa e dinâmica que separa fisicamente a corrente sanguínea do cérebro, sendo a principal responsável pela proteção e homeostasia deste. Os modelos in vitro de BHE têm sido importantes não só na compreensão das diferentes fases de desenvolvimento e manutenção desta barreira, mas também no estudo detalhado dos mecanismos de transporte de neuro-fármacos e nanoformulações da corrente sanguínea para o cérebro. Durante esta tese de doutoramento, foram desenvolvidos dois projetos distintos que no essencial ambicionam compreender o papel de fatores solúveis e não solúveis no processo de diferenciação/desenvolvimento da BHE e avaliar o impacto de diferentes parâmetros físico-químicos na permeação da BHE e acumulação nas diferentes regiões neurogénicas. Num primeiro trabalho, células endoteliais com fenótipo semelhante às de cérebro foram derivadas a partir de células estaminais com pluripotência induzida (iPSCs), usando um protocolo inovador de diferenciação. O protocolo desenvolvido consiste em duas fases distintas, em que inicialmente as iPSCs foram diferenciadas em células endoteliais progenitoras, seguido pela indução de propriedades de BHE através da combinação de fatores solúveis e matriz extracelular. Os resultados obtidos demonstram que os fatores solúveis, nomeadamente o factor de crescimento vascular endotelial, Wnt3a e o ácido retinóico, mantêm de forma consistente os marcadores endoteliais e a funcionalidade da BHE nestas células, apresentando-se como fatores cruciais para a indução do fenótipo de BHE. No segundo trabalho, combinámos três elementos fundamentais em diferentes nanoformulações i) morfologia da nanopartícula, ii) densidade de peptídeo de transferrina (Tf) na superfície da nanopartícula e iii) capacidade de resposta a um estímulo de luz, que nos permitem modelar a permeação da BHE e essencialmente, promover a acumulação das nanoformulações nos nichos neurogénicos. Observou-se usando um modelo in vitro da BHE, derivado de células estaminais hematopoiéticas, que as nanopartículas esféricas (Au NPs) e em forma de bastão (Au NRs), quando conjugadas com um número de peptídeos de Tf entre 169 e 230, atravessam de forma mais eficiente a BHE. Adicionalmente, em murganhos, demonstrou-se que a administração na veia da cauda de Au NRs-Tf169 apresentam uma maior acumulação nas regiões neurogénicas, quando ativados por luz próxima do infra vermelho. Com este estudo, fomos também capazes de confirmar que o nosso modelo in vitro de BHE, obtido a partir de células estaminais hematopoiéticas, é capaz de prever os resultados obtidos in vivo. Com estes dois trabalhos, desenvolvidos ao longo desta tese de doutoramento, fomos capazes de avançar na compreensão dos fatores cruciais envolvidos no desenvolvimento da BHE e dos mecanismos subjacentes à capacidade de permeação da BHE pelas nanoformulações, e em particular o direcionamento para os nichos neurogénicos.
The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic and complex structure that physically separates the bloodstream from the brain being responsible for its homeostasis and protection. In vitro BBB models are important to understand the crucial steps that occur during BBB development and maintenance. Moreover, they allow to disclosure important features related to the transport mechanisms of neuropharmaceuticals and nanoformulations from the blood to the brain. During the development of this PhD thesis, two major projects were fostered in order to understand the role of soluble and non-soluble cues in the process of BBB differentiation/development, and how different parameters can affect the nanoformulations targeting to the brain neurogenic niches. In the first work, we have generated brain-like endothelial cells derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), using a novel methodology of a two-step differentiation protocol. The iPSCs cells were initially differentiated into endothelial progenitor cells followed by the induction of BBB properties with a combination of soluble factors and extracellular matrices. Our results show that soluble factors, namely vascular endothelial growth factor, Wnt3a and retinoic acid are crucial for the induction of the BBB phenotype as observed by a better maintenance of the endothelial markers and BBB functionality. In the second work, we have combined three major elements in the nanoformulations, i) nanoparticles morphology, ii) transferrin (Tf) peptide density on the surface of the nanoparticles and iii) responsiveness to light stimuli, to fine-tune the BBB penetration, and more importantly to promote the accumulation of the nanoformulations in the neurogenic niches. Results obtained in a human in vitro BBB model, derived from hematopoetic stem cells, showed that spherical (Au NPs) and rod shape (Au NRs) nanoparticles conjugated with a number of Tf peptides between 169 and 230 crossed more efficiently the barrier than formulations with higher or lower peptide density per nanoformulation. Using mice animal model, we further showed that intravenously administered of Au NRs-Tf169 activated by a near infrared light had the highest accumulation in the neurogenic niches. Moreover, we have proved with this work, that our human BBB in vitro model, derived from hematopoietic stem cells, is able to predict in a reliable manner the in vivo outcome. With these two works we were able to give a step forward into a deep understanding of the crucial factors involved in the BBB development and the mechanisms underlying the BBB crossing and particularly the targeting to the neurogenic niches.
La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une structure dynamique assurant l'homéostasie du tissu cérébral. Localisée au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux, elle constitue un filtre sélectif entre le compartiment sanguin et le compartiment cérébral. L'utilisation de modèles in vitro permet l'étude du développement et du maintien du phénotype de la BHE. Elle permet également de comprendre la fonctionnalité de la BHE notamment les mécanismes de transport qui interviennent lors des échanges spécifiques entre les compartiments sanguin et cérébral. Dans un premier temps, de façon à étudier, in vitro, le rôle de différents facteurs dans le développement de la BHE, la différenciation de cellules endothéliales cérébrales a été réalisée à partir de cellules pluripotentes induites. Les résultats montrent que les facteurs solubles en particulier le VEGF, Wnt3a et l'acide rétinoïque sont cruciaux pour l'induction du phénotype de BHE dans les progéniteurs vasculaires. Dans un deuxième temps, le ciblage de niches neurogènes a été exploré in vivo en fonction de la formulation de nanovecteurs. En combinant 3 éléments majeurs de la formulation (morphologie, densité de la transferrine en surface et réponse à la lumière), l'accumulation des nanoparticules a été favorisée au niveau des niches neurogènes montrant ainsi que la pénétration cérébrale a été améliorée. L'utilisation en parallèle d'un modèle cellulaire de BHE réalisée à partir de cellules souches hématopoïétiques, a montré que les résultats obtenus in vitro prédisent de façon fiable, l'augmentation du passage à travers la BHE observée in vivo.
Description: Tese de doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, na especialidade de Biotecnologia e Saúde, apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/32374
Rights: embargoedAccess
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