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Title: Association of compound 48/80 with chitosan based nanoparticles: designing a novel prototypic delivery system for nasal vaccination
Authors: Bento, Dulce Marisa Ferreira 
Orientador: Borges, Olga
Gonçalves, Teresa
Keywords: nanoparticulas; ativadores de mastócitos; vacinas; C48/80; quitosano; vacinas de mucosas; administração nasal; vacina para o anthrax; dose de antigénio; combinação de adjuvantes; nanoparticles; vaccines; mast cell activators; mucosal vaccination
Issue Date: 9-Feb-2017
Citation: BENTO, Dulce Marisa Ferreira - Association of compound 48/80 with chitosan based nanoparticles : designing a novel prototypic delivery system for nasal vaccination. Coimbra : [s.n.], 2017. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/32137
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/65141/2009/PT 
info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876-PPCDTI/115044/PT 
info:eu-repo/grantAgreement/FCT/COMPETE/132990/PT 
Abstract: A vacinação é considerada como uma das medidas de saúde publica de controlo de doenças infetocontagiosas mais eficazes na civilização moderna. Os programas de imunização em larga escala diminuíram significativamente a morbilidade e mortalidade atribuídas às doenças infeciosas. A melhoria das vacinas atuais, e o desenvolvimento de vacinas para doenças contra as quais ainda não existem vacinas eficazes, são linhas de investigação de grande importância e com grande impacto na saúde pública e na sociedade. Particularmente, o desenvolvimento de vacinas para administração pelas mucosas será altamente desejável dado que, para além de permitir uma mais fácil administração, permitirá conferir proteção imunológica específica no local de entrada dos patogéneos. A colocação no mercado deste tipo de vacinas tem sido adiada devido à falta de adjuvantes seguros e eficazes para estas vias de administração. O objetivo deste projeto foi desenvolver um novo sistema de entrega de antigénios, com função adjuvante, para vacinação nasal. Este sistema de entrega é composto por dois adjuvantes para as mucosas, os quais, individualmente, em ensaios pré-clínicos, já mostraram ser muito promissores: nanopartículas de quitosano e um ativador de mastócitos, o composto 48/80 (C48/80). Esta é a primeira vez que é descrita a combinação do C48/80 com nanopartículas com o objetivo de desenvolver uma melhor formulação adjuvante para vacinas. Foram desenvolvidos dois sistemas de entrega, tendo por base o quitosano para a formação de nanopartículas, e nas quais se encapsulou o C48/80: Quitosano-C48/80 NP (Chi-C48/80 NP) e Quitosano/Alginato-C48/80 NP (Chi/Alg-C48/80 NP). As duas formulações foram caracterizadas e avaliadas in vitro. À posteriori, estudos in vivo avaliaram o seu potencial como adjuvantes para vacinas nasais. Para auxiliar no desenvolvimento das nanopartículas carregadas com C48/80, foi desenvolvido um método colorimétrico com deteção por espetrofotometria UV-Vis para a quantificação do C48/80. Este método foi validado de acordo com as recomendações das normas ICH para os seguintes parâmetros: especificidade, gama de trabalho e linearidade, exatidão, precisão e limites de deteção e de quantificação. As nanopartículas desenvolvidas no decurso deste projeto, Chi-C48/80 NP e Chi/Alg-C48/80 NP apresentaram um tamanho médio de 501 nm e 564 nm, respetivamente, e ambas apresentaram um potencial zeta positivo. A eficácia de carregamento do C48/80 foi 19 % para as Chi-C48/80 NP e 30 % para as Chi/Alg-C48/80 NP. Estudos de citotoxicidade demonstraram que a incorporação do C48/80 nos sistemas de entrega diminui a toxicidade do imunopotenciador. Estudos in vitro de internalização revelaram que as Chi-C48/80 NP foram internalizadas por células apresentadoras de antigénio mais eficientemente que as Chi/Alg-C48/80 NP. A capacidade das nanopartículas desenvolvidas para ativarem mastócitos foi também testada in vitro usando o ensaio de libertação de β-hexosaminidase. Os resultados demonstraram que a associação do C48/80 com as Chi NP, mas não com as Chi/Alg NP, resultou numa maior ativação de mastócitos quando comparado com o C48/80 em solução. Para avaliar se as particulas mucoadesivas, à base de quitosano, conseguiam aumentar o tempo de residência do antigénio na cavidade nasal, foi realizado um estudo in vivo de clearance nasal. Com esse objetivo foi usada ovalbumina marcada com fluorescência, adsorvida às nanopartículas. Neste estudo as Chi-C48/80 NP superaram novamente as Chi/Alg-C48/80 NP aumentando significativamente o tempo de residência do antigénio na cavidade nasal. A aptidão das nanopartículas desenvolvidas para potenciarem uma resposta imune, foi avaliada em murganhos C57BL/6 usando a imunização nasal com o antigénio protetor (PA) do B. anthracis como sistema modelo. A imunização usando as Chi-C48/80 NP como adjuvante induziu títulos elevados de anticorpos neutralizantes anti-PA no soro e títulos de anticorpos IgG2c anti-PA mais elevados do que as Chi/Alg-C48/80 NP. A incorporação do C48/80 nas Chi NP também promoveu uma imunidade nas mucosas melhor que a induzida por todos os outros grupos testados. Estes estudos de vacinação demonstraram que as Chi-C48/80 NP exibiram um desempenho melhor como adjuvante para a mucosa nasal que as Chi/Alg-C48/80 NP. Além disso, um estudo de dose-resposta revelou que as Chi-C48/80 NP permitiram diminuir seis vezes a dose de antigénio usada, sem afetar os títulos de anticorpos IgG específicos e neutralizantes. Estes resultados sugerem que esta inovadora combinação de adjuvantes, Chi NP com C48/80, tem potencial para diminuir a dose de antigénio necessário a incluir numa formulação comercial da vacina. De um modo geral, os resultados obtidos com este projeto demonstram que a combinação de nanopartículas de quitosano com um ativador de mastócitos é uma estratégia promissora para a imunização nasal, induzindo uma resposta imune potente, tanto sistemicamente como nas mucosas.
Vaccination is considered one of the greatest medical achievements of modern civilization and large scale immunization programs greatly reduced the global burden of infectious diseases. Therefore, improvement of current vaccines and development of vaccines against diseases for which successful vaccines are not currently available would bring huge benefits for public health and for the society. The development of mucosal vaccines would be highly desirable since it would provide protection at the local of entry of pathogens. However, the development of mucosal vaccination strategies has been delayed for the lack of effective and safe mucosal adjuvants. The objective of this project was to develop a novel prototypic delivery system for nasal vaccination composed by two highly promising mucosal adjuvant candidates: chitosan nanoparticles and the mast cell activator compound 48/80 (C48/80). This is the first time that the combination of C48/80 with nanoparticles in order to develop an improved adjuvant formulation is described. Two different C48/80 loaded chitosan-based delivery systems were developed: Chitosan-C48/80 NP (Chi-C48/80 NP) and Chitosan/Alginate-C48/80 NP (Chi/Alg-C48/80 NP). The two C48/80 loaded delivery systems were characterized and evaluated in vitro. Subsequently, in vivo studies assessed their potential as nasal adjuvants. To support the development of C48/80 loaded nanoparticles, a UV-Vis spectrophotometric method for quantification of C48/80 was developed. This method was validated according to the recommendations of ICH Guidelines for specificity, linearity, range, accuracy, precision and detection and quantification limits. Chi-C48/80 NP and Chi/Alg-C48/80 NP had a mean size of 501 nm and 564 nm, respectively, and were both positively charged. Loading efficacy of C48/80 was 19 % for Chi-C48/80 NP and 30 % for Chi/Alg-C48/80 NP. Cytotoxicity studies performed in two different cell types showed that incorporation of C48/80 in both formulations resulted in a decreased toxicity of the immunopotentiator compared with C48/80 in solution. In vitro uptake studies showed that Chi-C48/80 NP were more efficiently internalized by antigen presenting cells than Chi/Alg-C48/80 NP. The ability of the developed nanoparticles to activate mast cells was tested in vitro using the β-hexosaminidase release assay. Results demonstrated that association of C48/80 with Chi NP but not with Chi/Alg NP enhanced mast cell activation when compared with C48/80 in solution. To see if the mucoadhesive chitosan-based nanoparticles could increase the residence time of an antigen, an in vivo nasal clearance study of fluorescently labelled ovalbumin loaded on nanoparticles was performed. Once again, Chi-C48/80 NP outperformed Chi/Alg-C48/80 NP significantly increasing ovalbumin residence time in the nasal cavity. Both delivery systems, Chi-C48/80 NP and Chi/Alg NP were then compared for their ability to induce antigen-specific serum IgG, mucosal IgA and serum lethal toxin-neutralizing antibody responses in C57BL/6 mice using nasal immunization with anthrax recombinant protective antigen (PA) as a model system. Nasal immunization with Chi-C48/80 NP as adjuvant elicited high levels of serum anti-PA neutralizing antibodies and higher antigen-specific IgG2c than Chi/Alg-C48/80 NP. The incorporation of C48/80 within Chi NP also promoted a mucosal immunity greater than all the other adjuvanted groups tested. These vaccination studies showed that Chi-C48/80 NP displayed a better performance as nasal adjuvant than Chi/Alg-C48/80 NP. Additionally, an antigen dose-response study showed that Chi-C48/80 NPs allowed a 6-fold decrease of the antigen dose without affecting the levels of specific IgG titers and its neutralizing ability. These results suggest the potential of this novel adjuvant combination to decrease the antigen dose required for vaccination. Overall, the findings of this project show that the combination of a mast cell activator with chitosan nanoparticles is a promising strategy for nasal immunization inducing potent systemic and mucosal immune responses.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Tecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/32137
Rights: embargoedAccess
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