Novos esteróides inibidores da biossíntese de androgénios

Abstract

O cancro da próstata é uma doença multifactorial com grande impacto a nível mundial. O aumento da esperança média de vida das populações e da divulgação e uso de métodos de detecção do cancro da próstata, especialmente o PSA, contribuíram bastante para uma modificação do perfil do doente típico de há 50 anos atrás. Era habitual diagnosticar-se cancro da próstata apenas em estadios avançados devido a doença metastática, representando o diagnóstico geralmente uma sentença de morte em 1-2 anos. É actualmente possível diagnosticar o cancro da próstata num estadio muito precoce e potencialmente curável por intervenção cirúrgica ou uso de radiação. O tratamento do cancro da próstata faz-se em função do estadio da doença, da expectativa do número de anos de vida do paciente, dos efeitos laterais associados à terapêutica e da preferência do paciente. As terapêuticas hormonais disponíveis para o seu tratamento baseiam-se na descoberta de Huggins et al., em 1941, que mostrou que o crescimento e progressão do cancro da próstata dependiam do nível de androgénios do organismo, e lhe valeu o Prémio Nobel da Medicina. A CYP17 é uma das enzimas envolvidas na biossíntese de androgénios no corpo humano. A inibição da sua actividade tem sido reconhecida historicamente como uma estratégia importante para o tratamento do cancro da próstata, como forma de reduzir o nível de androgénios circulantes e assim impedir o crescimento e progressão da doença. O primeiro inibidor da CYP17 a ser usado em prática clínica foi o cetoconazol, um composto não esteróide com actividade antifúngica, que se descobriu induzir o desenvolvimento de ginecomastia em pacientes do sexo masculino. Após o cetoconazol, foram sintetizados e avaliados uma série de compostos esteróides e não esteróides como inibidores da CYP17, numa tentativa de encontrar moléculas mais potentes e melhorar o perfil de efeitos adversos a ele associado. No decurso deste trabalho foram sintetizados novos compostos esteróides de núcleo androstano tendo por base as considerações gerais de estrutura-actividade conhecidas para os inibidores da CYP17, como potenciais agentes úteis no tratamento do cancro da próstata. As duas estratégias de síntese diferentes exploradas permitiram a obtenção de dois grupos de compostos, os quais foram designados genericamente de derivados do indazole e C17 carbamatos derivados do 2’- metilimidazole. A elucidação estrutural dos novos compostos sintetizados foi feita com base em técnicas de IR, espectrometria de massa e 1H e 13C NMR 1D e 2D. Os derivados do indazole sintetizados, à semelhança de outros compostos esteróides que se revelaram bons inibidores da CYP17, possuem além do heterociclo com electrões disponíveis para coordenação com o Fe heme da enzima ligado ao C17, uma dupla ligação em C16. Os C17 carbamatos derivados do 2’-metilimidazole têm a particularidade de a função carbamato funcionar como espaçador e aumentar assim a distância entre o heterociclo e o C17. Quando avaliados para a inibição da CYP17 humana, apenas dois dos C17 carbamatos derivados do 2’-metilimidazole inibiram a enzima, ainda que de forma menos potente que o cetoconazol. Os derivados do indazole não revelaram potencial inibitório da enzima. Foram apresentadas e discutidas razões possíveis para esta observação. O bloqueio da actividade do receptor de androgénio é também uma estratégia fundamental no contexto do tratamento do cancro da próstata, uma vez que a progressão da doença lhe está intimamente associada. Em particular, o aumento do número destes receptores e o aparecimento de receptores mutados têm sido apontados como mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento de resistência a níveis muito baixos de androgénios no organismo, tornando ineficazes as estratégias terapêuticas referidas anteriormente. Foi demonstrado que compostos concebidos como inibidores da CYP17 possuíam propriedades desejáveis do ponto de vista de ligação ao receptor de androgénios e inibição da transcrição por ele mediada, abrindo-se assim um novo capítulo na avaliação pré-clínica deste tipo de compostos. Neste contexto, a afinidade dos derivados do indazole e dos C17 carbamatos derivados do 2’-metilimidazole para o receptor de androgénio original e mutado, usando células de metástases ósseas do cancro da próstata LAPC4 e LNCaP, foi estudada. O efeito destes compostos sobre a transcrição mediada pelo receptor mutado (das células LNCaP) na presença e ausência do ligando natural di-hidrotestosterona, foi avaliado com recurso ao gene reportador luciferase. Em geral, a função carbamato dos C17 carbamatos derivados do 2’- metilimidazole permitiu uma excelente afinidade para o receptor de androgénio. O efeito promovido por esta classe de compostos sobre a transcrição mediada pelo receptor de androgénio mutado revelou-se dependente da concentração. Os derivados do indazole não mostraram boa afinidade para o receptor de androgénio. A capacidade de inibição da proliferação celular das linhas celulares do cancro da próstata LAPC4, LNCaP e PC-3 foi também estudada para os novos compostos sintetizados, usando ensaios baseados na redução de sais de formazana. Ambos os grupos de novos compostos sintetizados foram particularmente interessantes do ponto de vista de inibição da proliferação das células PC-3, que não expressam o receptor de androgénio e representam um modelo de estudo do cancro da próstata avançado.

ABSTRACT Prostate cancer is a multifactorial disease with worldwide impact. Both the rise in the life expectancy of the general population and the growing public awareness and use of the screening methods available for the disease, particularly PSA, have greatly contributed to changing the typical prostate cancer patient’s profile from that of 50 years ago. Prostate cancer was usually diagnosed only at an advanced stage due to metastatic disease and the diagnosis was seen as a death sentence in 1-2 years. Nowadays, the disease can be diagnosed in its early stages and it is potentially curable by surgical or radiological approaches. Prostate cancer management and treatment options are currently considered in face of the stage of the disease, the patient’s life expectancy, the adverse effects’ profile of the available therapeutic options and patient preference. Hormonal treatments for prostate cancer therapy are based on the Nobel Prize winner discovery by Huggins et al., in 1941, that the growth and progression of prostate cancer cells depends on androgen levels in the body. CYP17 is one of the enzymes involved in androgen biosynthesis in the human body. Its inhibition has tradicionally been recognized as an important strategy for prostate cancer treatment as a way to lower androgen levels and thus stop disease progression. Cetoconazole, a non steroidal antifungal compound which was reported to cause gynecomastia in male patients, was the first to be used clinically for prostate cancer treatment. After cetoconazole, a series of compounds, both steroidal and non steroidal, have been synthesized and evaluated as CYP17 inhibitors in the hope of finding more potent molecules with a better side effects’ profile. The aim of the present work was to synthesize new steroidal compounds bearing the androstane backbone, which correlated well with the known structure-activity dispositions currently accepted for CYP17 inhibitors, and would thus contribute to prostate cancer treatment. Two different synthetic strategies have been exploited which resulted in the preparation of two sets of compounds generally designated as indazole derivatives and C17 2’-methylimidazole derived carbamates. The structural elucidation of these novel compounds was performed based on IR, mass spectrometry and 1H and 13C NMR 1D and 2D techniques. The synthesized indazole derivatives, alike other steroidal compounds which have been found to be good CYP17 inhibitors, possess not only an heterocyclic moiety with available electrons capable of coordination with the heme Fe of the enzime, but also a C16 double bond. In the synthesized C17 2’-methylimidazole derived carbamates, the carbamate function acts as a spacer group, increasing the distance between the heterocyclic moiety and C17. Only two of the synthesized C17 2’-methylimidazole derived carbamates inhibited the human CYP17 enzyme, however less potently than ketoconazole. The indazole derivatives were found to be non-inhibitory. Possible reasons for this occurrence have been presented. Blockage of androgen receptor function is also a fundamental strategy for prostate cancer treatment because disease progression is intimately related to it. Both the rise in the number of available receptors and the presence of mutated receptors have been reported as important for the development of resistance to very low androgen levels in the body, thus making the previously mentioned therapeutic strategies ineffective. The fact that compounds which were designed as CYP17 inhibitors have been reported to antagonize the androgen receptor and inhibit androgen receptor mediated transcription, has opened a new chapter in the pre-clinical assessment of this type of compounds. In the face of this new context, the affinity of the indazole derivatives and the C17 2’-methylimidazole derived carbamates, towards both the original and the mutated the androgen receptor, using metastatic prostate cancer cell lines such as LAPC4 and LNCaP, was also studied. The effect of these novel compounds on mutated androgen receptor mediated transcription (on LNCaP cells), both in the presence and absence of the natural ligand dihydrotestosterone, was evaluated using the luciferase reporter assay. In general, the C17 2’-methylimidazole derived carbamates bound to the androgen receptor with excelent affinity. Their effect on mutated androgen receptor mediated transcription was found to be concentration dependent. The indazole derivatives did not display good affinity towards the androgen receptor. The ability to inhibit prostate cancer cell line proliferation (LAPC4, LNCaP and PC-3 cells) was studied for the new synthesized compounds based on the reduction of formazan salts. Both groups of compounds were particularly effective in inhibiting the proliferation of PC-3 cells which do not express the androgen receptor, and thus represent a model of study for the more advanced stages of prostate cancer.