Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/31882
Title: Metabolic control of neuronal activity by fuel substrate switching: a role for BAD
Authors: Carlton, Sofia Marques Ribeiro 
Orientador: Danial, Nika
Palmeira, Carlos
Issue Date: 16-Dec-2016
Citation: CARLTON, Sofia Marques Ribeiro - Metabolic control of neuronal activity by fuel substrate switching : a role for BAD. Coimbra : [s.n.], 2016. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/31882
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/51200/2010/PT 
Abstract: Fuel metabolism is important not only for providing energy to neurons and astrocytes in the brain, but also as a key regulator of neuronal activity. A remarkable example of how metabolism can alter brain activity is the strong resistance to epileptic seizures displayed by mice with deletion or alteration of BAD, a BCL-2 family protein that imparts reciprocal effects on glucose and ketone body metabolism independent of its ability to regulate apoptosis. BAD modifications lead to reduced mitochondrial oxidation of glucose and concomitantly enhance ketone body oxidation in neural cells. The metabolic shift upon BAD modification, increased propensity to consume ketone bodies in face of diminished glucose metabolism, recapitulates the actual change in fuel consumption by the brain in fasting or on ketogenic diet, a high fat, low carbohydrate diet that has been successfully used to treat epileptic seizures. However, these BAD-dependent changes occur in the absence of dietary manipulation, providing a new molecular and cellular handle on the metabolic control of neuronal activity. Compared with systemic effects of dietary alterations, the seizure resistance in BAD mutant mice appears likely to arise from alterations in brain cell metabolism rather than systemic changes. This provides an opportunity to test and define the metabolic contributions to regulation of neuronal activity at the molecular level in a way that has not been easy with dietary manipulations due to their systemic effects. How does BAD alter the metabolism of glucose and ketone bodies, and how are these changes in fuel substrate metabolism related to neurotransmission? The answers to these questions will help define a metabolic signature for the BAD-dependent glucose-to-ketonebody fuel switch and provide valuable insights into the metabolic state associated with seizure protection. To answer these questions, we undertook an integrative and multidisciplinary approach comprised of targeted metabolomics analyses using 13C-glucose and ketone body tracers, quantitative proteomics and biochemical studies. We have found that diminished glucose oxidation in BAD mutant neurons maps to a defect in the lower arm of the glycolytic pathway that consequently diminishes TCA cycle activity. Our studies also show that diminished TCA cycle activity in response to glucose is linked to reduced availability of vi glucose-derived pyruvate rather than a more generalized defect in mitochondrial entry or handling of pyruvate. In comparison, ketone bodies led to significantly higher increase in TCA cycle flux in BAD mutant neurons. Remarkably, this appears to be associated with higher availability of metabolic precursors for the synthesis of the inhibitory neurotransmitter -aminobutyric acid (GABA) as well as an actual increase in GABA pools. These data provide new information about potential changes in neurotransmission that might be directly derived from altered fuel utilization in BAD mutant neurons. In an effort to delve deeper into the biochemical underpinning of BAD’s effect on fuel utilization, we sought to identify the BADinteracting partners in the brain. Our initial multipronged approach to protein-protein interactions has revealed that BAD is present in higher molecular weight complexes the components of which are under current investigation. Overall, the studies described herein begin to provide an integrated molecular view at the level of metabolite fluxes and biochemical interactions that underlie BAD-dependent reciprocal utilization of glucose and ketone bodies in the brain and their influence on neuronal excitability as it relates to seizure responses. In the fullness of time, this work may have broader implications and utility for identifying and predicting other genetic and pharmacologic manipulations of metabolism that may similarly induce a glucose-to-ketone-body fuel switch and protect against seizures. O metabolismo energético é importante não só para fornecer energia a neurónios e astrócitos no cérebro, mas funciona também como um regulador fundamental da actividade neuronal. Um exemplo notável de como o metabolismo pode alterar a actividade cerebral é a profunda resistência a convulsões epilépticas apresentada por ratinhos com uma deleção ou alteração da BAD, uma proteína da família BCL-2 que possui efeitos recíprocos no metabolismo da glucose e corpos cetónicos, independentemente da sua capacidade de regular a apoptose. As modificações na BAD levam a uma reduzida oxidação mitocondrial e, consequentemente, a um aumento da oxidação de corpos cetónicos em células neuronais. Este desvio metabólico resultante de modificações da BAD, que aumenta a propensão para o consumo de corpos cetónicos devido à diminuição do metabolismo da glucose, mimetiza as alterações que ocorrem no consumo energético pelo cérebro em jejum, ou quando sujeito a dietas cetógénicas. Estas dietas, ricas em gorduras e com baixo teor de hidratos de carbono, têm sido utilizadas de forma eficaz no tratamento de convulsões epilépticas. Contudo, estas alterações dependentes da BAD ocorrem independentemente de manipulações da dieta, evidenciando um novo papel molecular e celular desta proteína no controlo metabólico da actividade neuronal. Em comparação com os efeitos sistémicos de alterações nutricionais, a resistência a convulsões em ratinhos mutantes para a BAD parece ser consequência de alterações específicas ao nível do metabolismo celular no cérebro, e não de alterações sistémicas. Estas observações constitutem uma oportunidade para testar e definir as contribuições metabólicas para a regulação da actividade neuronal ao nível molecular, de uma forma que não foi até agora possível com manipulações nutricionais, devido aos efeitos sistémicos que estas causam. As questões que se impõem são: como é que a BAD altera o metabolismo da glucose e corpos cetónicos e como é que estas alterações nos substratos do metabolismo energético se relacionam com a neurotransmissão? As respostas a estas perguntas vão permitir definir uma assinatura metabólica para a mudança de substrato energético de glucose para corpo cetónico dependente da BAD e reunir factos determinantes no que diz respeito ao estado viii metabólico associado à protecção contra convulsões. Para responder às questões acima mencionadas adoptámos uma estratégia integrativa e multidisciplinar que envolve análises de metabolómica direccionadas, utilizando dois marcadores de 13C-glucose e corpos cetónicos, proteómica quantitativa e estudos bioquímicos. Observou-se que a diminuição da oxidação da glucose em neurónios mutantes para a BAD aponta para uma falha nas etapas finais da via glicolítica que, consequentemente, diminui a actividade do ciclo dos TCA. Estes estudos também demonstram que uma diminuição da actividade do ciclo dos TCA, em resposta à glucose, está relacionada com uma diminuição no piruvato derivado de glucose, ao invés de um defeito generalizado na transferência ou oxidação do piruvato na mitocôndria. Em comparação, os corpos cetónicos levaram a um aumento significativo do fluxo do ciclo dos TCA, em neurónios mutantes para a BAD. Este fenómeno parece estar associado a um aumento nos níveis de percursores metabólicos para a síntese do neurotransmissor inibitório ácido γ-aminobutírico (GABA), bem como um aumento das reservas de GABA. Os resultados aqui apresentados mostram as potenciais alterações na neurotransmissão que podem ser consequência directa de uma alteração da utilização de substratos metabólicos pelos neurónios mutantes para a BAD. De modo a analizar detalhadamente o mecanismo bioquímico por detrás dos efeitos da BAD na utilização de substratos metabólicos, propusemo-nos a identificar parceiros de interacção da BAD no cérebro. Numa primeira e ampla abordagem a interacções proteicas, concluiu-se que a BAD está presente em complexos de alto peso molecular cujos componentes específicos estão a ser investigados. Em geral, os estudos aqui descritos são o ponto de partida para obter uma visão molecular integrada dos fluxos metabólicos e interacções biológicas que estão subjacentes à utilização recíproca de glucose e corpos cetónicos dependentes da BAD no cérebro e do seu efeito na excitabilidade neuronal e covulsões epilepticas. No futuro, este trabalho poderá ter amplas implicações e ser de extrema utilidade para a identificação e desenvolvimento de outras manipulações genéticas e farmacológicas do metabolismo que, de forma semelhante, podem induzir uma alteração de glucose para corpo cetónico e assim proteger contra convulsões.
O metabolismo energético é importante não só para fornecer energia a neurónios e astrócitos no cérebro, mas funciona também como um regulador fundamental da actividade neuronal. Um exemplo notável de como o metabolismo pode alterar a actividade cerebral é a profunda resistência a convulsões epilépticas apresentada por ratinhos com uma deleção ou alteração da BAD, uma proteína da família BCL-2 que possui efeitos recíprocos no metabolismo da glucose e corpos cetónicos, independentemente da sua capacidade de regular a apoptose. As modificações na BAD levam a uma reduzida oxidação mitocondrial e, consequentemente, a um aumento da oxidação de corpos cetónicos em células neuronais. Este desvio metabólico resultante de modificações da BAD, que aumenta a propensão para o consumo de corpos cetónicos devido à diminuição do metabolismo da glucose, mimetiza as alterações que ocorrem no consumo energético pelo cérebro em jejum, ou quando sujeito a dietas cetógénicas. Estas dietas, ricas em gorduras e com baixo teor de hidratos de carbono, têm sido utilizadas de forma eficaz no tratamento de convulsões epilépticas. Contudo, estas alterações dependentes da BAD ocorrem independentemente de manipulações da dieta, evidenciando um novo papel molecular e celular desta proteína no controlo metabólico da actividade neuronal. Em comparação com os efeitos sistémicos de alterações nutricionais, a resistência a convulsões em ratinhos mutantes para a BAD parece ser consequência de alterações específicas ao nível do metabolismo celular no cérebro, e não de alterações sistémicas. Estas observações constitutem uma oportunidade para testar e definir as contribuições metabólicas para a regulação da actividade neuronal ao nível molecular, de uma forma que não foi até agora possível com manipulações nutricionais, devido aos efeitos sistémicos que estas causam. As questões que se impõem são: como é que a BAD altera o metabolismo da glucose e corpos cetónicos e como é que estas alterações nos substratos do metabolismo energético se relacionam com a neurotransmissão? As respostas a estas perguntas vão permitir definir uma assinatura metabólica para a mudança de substrato energético de glucose para corpo cetónico dependente da BAD e reunir factos determinantes no que diz respeito ao estado metabólico associado à protecção contra convulsões. Para responder às questões acima mencionadas adoptámos uma estratégia integrativa e multidisciplinar que envolve análises de metabolómica direccionadas, utilizando dois marcadores de 13C-glucose e corpos cetónicos, proteómica quantitativa e estudos bioquímicos. Observou-se que a diminuição da oxidação da glucose em neurónios mutantes para a BAD aponta para uma falha nas etapas finais da via glicolítica que, consequentemente, diminui a actividade do ciclo dos TCA. Estes estudos também demonstram que uma diminuição da actividade do ciclo dos TCA, em resposta à glucose, está relacionada com uma diminuição no piruvato derivado de glucose, ao invés de um defeito generalizado na transferência ou oxidação do piruvato na mitocôndria. Em comparação, os corpos cetónicos levaram a um aumento significativo do fluxo do ciclo dos TCA, em neurónios mutantes para a BAD. Este fenómeno parece estar associado a um aumento nos níveis de percursores metabólicos para a síntese do neurotransmissor inibitório ácido γ-aminobutírico (GABA), bem como um aumento das reservas de GABA. Os resultados aqui apresentados mostram as potenciais alterações na neurotransmissão que podem ser consequência directa de uma alteração da utilização de substratos metabólicos pelos neurónios mutantes para a BAD. De modo a analizar detalhadamente o mecanismo bioquímico por detrás dos efeitos da BAD na utilização de substratos metabólicos, propusemo-nos a identificar parceiros de interacção da BAD no cérebro. Numa primeira e ampla abordagem a interacções proteicas, concluiu-se que a BAD está presente em complexos de alto peso molecular cujos componentes específicos estão a ser investigados. Em geral, os estudos aqui descritos são o ponto de partida para obter uma visão molecular integrada dos fluxos metabólicos e interacções biológicas que estão subjacentes à utilização recíproca de glucose e corpos cetónicos dependentes da BAD no cérebro e do seu efeito na excitabilidade neuronal e covulsões epilepticas. No futuro, este trabalho poderá ter amplas implicações e ser de extrema utilidade para a identificação e desenvolvimento de outras manipulações genéticas e farmacológicas do metabolismo que, de forma semelhante, podem induzir uma alteração de glucose para corpo cetónico e assim proteger contra convulsões.
Description: Tese de doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, na especialidade de Neurociências e Doença, apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/31882
Rights: embargoedAccess
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