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Title: Mechanisms involved in diabetes-associated osteoarthritis: role of autophagy
Authors: Ribeiro, Maria Madalena Azevedo Alves 
Orientador: Mendes, Alexandrina Maria Ferreira dos Santos Pinto
García, Francisco Javier Blanco
Keywords: Osteoartrite; Condrócitos; Cartilagem Articular; Membrana Sinovial; Diabetes Mellitus; Autofagia
Issue Date: 20-Jan-2017
Citation: RIBEIRO, Maria Madalena Azevedo Alves - Mechanisms involved in diabetes-associated osteoarthritis : role of autophagy. Coimbra : [s.n.], 2017. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/31652
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/78188/2011/PT 
Abstract: Devido às alterações no perfil sociodemográfico da população, a Osteoartrite (OA) e a Diabetes Mellitus tipo 2 (DM tipo 2), são agora altamente prevalentes, com um enorme impacto socioeconómico. A OA é uma doença multifatorial para a qual se desconhecem terapias eficazes, sendo por isso urgente identificar fenótipos específicos da OA que permitam desenvolver terapêuticas mais eficientes. Estudos epidemiológicos e experimentais sugerem uma associação entre OA e diabetes: OA é mais prevalente, mais severa e com início mais precoce em doentes diabéticos do que em não diabéticos. Esta evidência suporta a existência de um fenótipo específico da OA induzido pela diabetes. Perceber os mecanismos subjacentes a esta associação pode ser essencial para desenvolver terapias mais específicas. A cartilagem articular é um tecido pós-mitótico com uma baixa taxa de proliferação celular, dependendo de mecanismos homeostáticos, nomeadamente da autofagia, para manter a sua integridade e função. A autofagia é um processo catabólico que se encontra alterado tanto na OA como na diabetes. Contudo, os efeitos da diabetes na regulação da autofagia dos condrócitos permanecem por esclarecer. Neste contexto, o objetivo dessa tese é perceber se as condições diabéticas facilitam a progressão da OA e se o comprometimento da autofagia tem um papel importante neste processo. A nossa hipótese é de que a diabetes compromete a integridade da cartilagem através do seu efeito nas células dos tecidos articulares, em particular nos condrócitos, nomeadamente por redução na autofagia. Outro objetivo é avaliar se a ativação farmacológica da autofagia tem um efeito protetor e se pode constituir uma abordagem terapêutica para prevenir a OA associada à diabetes. Apesar de outras formas de diabetes, nomeadamente a DM tipo 1, poderem também afectar tecidos articulares, e pelo menos alguns dos mecanismos responsáveis poderem ser comuns, esta tese foca-se na DM tipo 2. Para atingir estes objetivos, foi utilizado um modelo in vitro simulando a hiperglicemia e hiperinsulinemia, características típicas da DM tipo 2 que também podem ser encontradas em doentes DM tipo 1 insulino-tratados. Assim, condrócitos humanos e explantes de cartilagem e uma linha de condrócitos foram cultivados num meio com alta glucose (25mM) e expostos a altas concentrações de insulina (10-1000nM). Usando este modelo, uma diminuição de marcadores de autofagia que, pelo menos em parte, foi mediada pelo aumento de atividade da via Akt/mTOR, foi observada. Estas condições diabéticas conduziram ainda a uma perda de proteoglicanos, a um aumento da expressão da enzima de degradação, MMP-13, e da citoquina pró-inflamatória, IL-1β, sugerindo um efeito pro-catabólico nos condrócitos e na cartilagem. A ativação farmacológica da autofagia, através da inibição do mTOR com a rapamicina, demonstrou prevenir a diminuição dos marcadores da autofagia e o incremento da inflamação, observados nestas condições diabéticas. Para além disso, foi observada uma diminuição nos níveis basais de marcadores da autofagia,LC3, e um aumento da actividade da via mTOR, detectado pelos níveis de p-rpS6, nos condrócitos de doentes OA diabéticos comparados com condrócitos de doentes OA não-diabéticos. No seu conjunto, estes resultados suportam a nossa hipótese de que uma diminuição da autofagia é um mecanismo importante pela qual a diabetes favorece a degradação da cartilagem. Para confirmar estes resultados e avaliar a sua relevância num contexto mais próximo do encontrado nos humanos, um estudo in vivo foi realizado. Assim, a OA foi induzida cirurgicamente, pela seção dos ligamentos meniscotibial e colateral medial, no joelho direito de murganhos obesos diabéticos (db/db), e murganhos lean não diabéticos. O joelho esquerdo foi utilizado como controlo. Os murganhos foram divididos em três grupos: lean não tratados, db/db tratados com veículo, e db/db tratados com rapamicina. A rapamicina (2mg/kg peso) ou o veículo (dimetilsulfóxido) foram administrados por via intraperitoneal, 3 vezes por semana, durante 10 semanas. Após a indução da OA, os murganhos db/db tratados com veículo apresentaram um aumento na degradação da cartilagem, na inflamação sinovial, e na expressão biomarcadores da OA (MMP-13), e uma diminuição da celularidade, quando comparados com os murganhos lean. Uma diminuição na expressão de LC3 foi também observada nos murganhos db/db. Estes resultados mostram que a DM tipo 2 compromete a autofagia e acelera a OA induzida experimentalmente. Por sua vez, a ativação da autofagia induzida pela administração de rapamicina melhorou os parâmetros metabólicos, diminuiu a degradação da cartilagem e a inflamação sinovial, diminuiu marcadores catabólicos (MMP-13) e inflamatórios (IL-12), e aumentou a celularidade da cartilagem. A rapamicina aumentou também a expressão de LC3 nos tecidos articulares. Em nenhum dos grupos foram detetadas diferenças histológicas no joelho esquerdo (controlo). Estes resultados demonstram que a ativação farmacológica da autofagia atenua a severidade da OA induzida experimentalmente em murganhos db/db. Em suma, os resultados obtidos mostram que as condições diabéticas alteram a autofagia dos condrócitos, tanto in vitro como in vivo, e que isso facilita o desenvolvimento e progressão da OA, apontando a alteração da autofagia como um dos possíveis mecanismos envolvidos na degradação da cartilagem induzida pela diabetes. Este estudo demonstra ainda que a ativação farmacológica da autofagia, pela inibição do mTOR, é suficiente para proteger contra a degradação da articulação induzida pela diabetes. Assim, a ativação farmacológica da autofagia surge como uma potencial estratégia para prevenir ou parar a progressão da OA em doentes diabéticos.
Ongoing sociodemographic changes are leading to an increase in the prevalence of both Osteoarthritis (OA) and Type 2 Diabetes Mellitus (T2D), resulting in a tremendous socioeconomic burden. Since OA is a multifactorial disease with no efficient treatment options available, there is an urgent need to identify different OA phenotypes to establish effective therapies. Evidence from experimental and epidemiological data suggests an association between OA and diabetes: OA is more prevalent, more severe and has an earlier onset in diabetic patients. With this evidence a new OA phenotype emerges: diabetes-associated OA. Understanding the mechanisms underlying this association can be a key point in developing more effective therapies. Articular cartilage is a post-mitotic tissue with a low cell proliferation rate, depending on homeostatic mechanisms, especially autophagy, to maintain integrity and function. Autophagy is a catabolic process that is impaired in both OA and diabetes. However, the effect of diabetes on the regulation of autophagy in chondrocytes remains unknown. In this sense, the aim of this thesis is to understand whether diabetic conditions facilitate OA progression and whether autophagy impairment plays a role in the process. We hypothesize that diabetes impairs articular cartilage integrity by directly affecting joint tissue cells and chondrocytes in particular, namely by decreasing autophagy. Another goal is to evaluate if pharmacological activation of autophagy has a protective effect and can constitute a therapeutic approach to prevent diabetes-accelerated OA. Although other forms of diabetes, namely type 1, may also affect joint tissues, and at least some mechanisms may be common, in this thesis we mainly focus in T2D. To address these goals, we used an in vitro model mimicking hyperglycemia and hyperinsulinemia, the hallmarks of T2D, that also occur in type 1 diabetic patients under insulin therapy. Thus, human primary articular chondrocytes and cartilage explants and a chondrocytic cell line were cultured in a high glucose medium (25mM glucose) and exposed to high insulin concentrations (10 to 1000nM). Using this model, we found a decrease in autophagy markers that was partially mediated by increased activity of the Akt/mTOR pathway. The same diabetic conditions also led to proteoglycan loss, increased expression of the collagen-degrading enzyme, MMP-13, and of the pro-inflammatory cytokine, IL-1β, suggesting a pro-catabolic effect in chondrocytes and articular cartilage. Moreover, pharmacological autophagy activation, by inhibiting mTOR with Rapamycin, was also found to be effective in preventing the decrease in autophagy markers and the increase in inflammation observed under diabetic conditions. Importantly, we also found decreased basal levels of autophagy markers, namely LC3, and increased activity of the mTOR pathway as revealed by the levels of its downstream target, phospho-rpS6, in chondrocytes from diabetic OA patients compared to non-diabetic OA patients. Taken together, these findings support our hypothesis that a reduction of autophagy is an important mechanism by which diabetes favors cartilage degradation. To further corroborate these results and evaluate their relevance under more complex dynamic conditions closer to the human disease, we performed an in vivo study by surgically inducing OA in obese diabetic mice (db/db mice) and in non-diabetic lean mice. All animals were subjected to surgical OA induction by transection of the medial meniscotibial and the medial collateral ligaments in the right knee. The left knee was employed as a control. Mice were divided into three groups: untreated Lean, Vehicle-treated db/db, and Rapamycin-treated db/db mice. Rapamycin (2mg/kg weight) or Vehicle (dimethyl sulphoxide) were administered intraperitoneally, 3 times a week, for 10 weeks. After OA induction, Vehicle-treated db/db mice elicited increased cartilage damage and synovial inflammation, up-regulation of OA biomarkers (MMP-13), as well as decreased cartilage cellularity, compared to lean mice. Moreover, LC3 staining was also reduced in db/db mice. These results suggest that T2D compromises autophagy and accelerates experimental OA. Importantly, autophagy activation by Rapamycin treatment improved metabolic parameters, attenuated cartilage degradation and synovial inflammation, decreased catabolic (MMP-13) and inflammatory (IL-12) markers, and increased cartilage cellularity, in db/db mice with OA. Rapamycin also increased LC3 staining in joint tissues. No histopathological differences in the left control knee were observed among the three groups. These results show that autophagy activation reduces the severity of experimental OA in db/db mice. In conclusion, the results obtained show that diabetic conditions impair chondrocyte autophagy, both in vitro and in vivo, and this facilitates OA development and progression, suggesting that impaired autophagy can be one of the mechanisms involved in diabetes-associated OA. Moreover, pharmacological activation of autophagy through mTOR inhibition is sufficient to protect against diabetes-induced joint destruction. Therefore, pharmacological autophagy activation deserves to be further studied as a potential new strategy to prevent or stop OA progression in diabetic patients.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Farmacologia e Farmacoterapia, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/31652
Rights: openAccess
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