Neurobiology of the circadian clock: Metabolism control & Implications for Alzheimer´s disease

Abstract

To maintain organism homeostasis, organisms developed a system of endogenous molecular clocks to anticipate the momentum of the day and couple several physiological processes. A dysfunctional clock may be involved in several diseases, including metabolic syndromes and neurological disorders. Alzheimer’s disease (AD) patients display abnormal circadian rhythms, well before the appearance of cognitive deficits. There is evidence that: (i) a dysfunctional clock is responsible for metabolic syndromes and alterations in glucose and insulin levels, (ii) insulin affects β-amyloid levels, one the AD-associated peptides and (iii) AD patients have an altered circadian clock. Altered brain metabolism, namely impaired glucose utilization and energy metabolism, is observed early in AD progression. This occurs prior to a major hallmark of AD, the deterioration of cognitive functions. Therefore, energy failure appears to be one of the earliest symptoms of AD. Interestingly, disruption of the circadian system has been considered to be an early event in AD as well. Aging underlies a decline in many capabilities and body functions. The molecular clock also slowly loses its pace. This lost is a progressive process and seems to be a derivative of aging. Importantly, many of those processes are orchestrated by the circadian clock, which ‘times’ the homeostasis, cell cycle, as well as memory and learning. The body may also lose the ability of accurately tracking time and coordinate body functions, such as metabolism in all its different forms, namely lipidogenesis, adipogenesis, glucose and insulin metabolism. Thus, the repercussions on the synchrony of metabolic processes are implicit and might be of pivotal importance in the onset of age-related neurodegenerative diseases such as AD. The circadian system is a design model consisting of an oscillator responsible for the generation of the daily rhythm. It relates to input pathways, by which the environment and other components of the nervous system feedback information to the clock, and also to output routes, by which the oscillator provides temporal information to a wide range of physiological and behavioral processes. When cells are removed and maintained in a brain slice, they generate 24-hour rhythms of electrical activity, secretion, and gene expression. The amplitude of the electrical activity, gene expression and hormone‑secreting activity decline in the aging brain. Impairment of circadian clock synchronization displays major alterations throughout the body. These include changes in memory formation, as well as hormonal and neurochemical changes, with consequences for neuroplasticity. The triple transgenic (3xTg-AD) mouse model of AD displays abnormalities in circadian rhythmicity prior to AD pathology, making this mouse model instrumental to investigate the interplay between circadian clock, metabolism and the link to AD pathogenesis. Thus, in this study we aimed to unveil the impact of AD in biological rhythms relevant in pathology, as well as to gain a deeper understanding of the physiopathology. Initially, this study evaluated the impact of the circadian profile on cognitive performance in 24 week-old 3xTg-AD mice versus age-matched control (Non-Tg) mice, explored how this correlated with hippocampal long-term potentiation (LTP) and how mitochondrial function, an indicator of brain metabolism, was impacted by circadian biology. Our analysis was performed at Zeigeber (ZT) 04 (4 hours after lights on) and ZT 16 ( 4 hours after lights off). The diurnal variation, in hippocampus-dependent learning tasks of 3xTg-AD and Non-Tg animals was assayed. The Morris water maze (MWM) results showed that, independently of the time of day, cognitive deficits were observed in 3xTg-AD; indeed, a correlation between ZT’s and genotypes was only possible when making use of the Spatial Reverse learning task. These results suggested that the pattern of circadian variation of memory performance depends on the type of task and the impact of circadian clock on AD pathology is better outlined in more complex tasks. The amplitude of hippocampal LTP, an electrophysiological correlate of memory related processes, i.e. electrical signals recorded extracellularly at Schaffer fibers/CA1 pyramid synapses, exhibited a circadian profile in Non-Tg animals, which was not observed in 3xTg-AD mice. Disturbances in mitochondrial function and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of AD. Therefore, mitochondrial membrane potential (ΔΨm) was measured in cortical synaptosomes; exposure to hydrogen peroxide (H2O2) revealed increased mitochondrial depolarization at Zt16, suggesting a ZT-dependent susceptibility to oxidative stimulus. Simultaneously, intracellular calcium (iCa) levels were measured, revealing an inability of 3xTg-AD synaptosomes to maintain iCa levels at Zt16; H2O2 stimulus did not show significant changes between ZT´s or genotypes. Data suggest that, when challenged/stressed, the mitochondria unravel to be dysfunctional in the AD mouse model. These findings are in agreement with the oxidative stress hypothesis for AD. We concluded that, at this stage, there is impairment of the circadian rhythm on key traits of AD pathogenesis; the study further outlines the prevalence of diurnal variation and pinpoints the need to better characterize the neurobiology of disease and integration of circadian rhythms as a crucial variable. Moreover, it supported the idea of mitochondrial dysfunction and increased susceptibility to oxidant stimulus. NMR has been largely used as a method for longitudinal studies of metabolites and biochemical pathways. Therefore, metabolic analysis was also performed using this technique. This technique allows to measure, under baseline conditions, the direct pathway (hepatic glycogen synthesis from intact hexose) and indirect pathway (hepatic glycogen synthesis from gluconeogenic processing). The administration of deuterated water (2H2O) leads to positional 2H-enrichment of hepatic glycogen, rendering the effect of a disease (e.g. type 2 diabetes or other interventions on these fluxes (circadian disruptions) accessible to in vivo evaluation. At the age of 6 months (24 wks) the pathology in 3xTg-AD mice has been described to be established. Thus, in the second chapter we proved that at this age the cognitive decline, electrophysiological and mitochondrial dysfunction were present. Then, we posed a question regarding the circadian rhythm: Are biological rhythms impaired in AD? Data outlined the relevance of the diurnal variation studies in pathology. We showed that AD impairs biological rhythms, similarly to a circadian disruption.

Animals were given intraperitoneally a bolus of 1% 2H2O 24h prior to euthanazia and the liver used. mRNA and metabolites were extracted and analyzed, by QPCR and NMR, respectively. Biological samples of 3xTg-AD and Non-Tg mice were collect at ZT 04 & ZT 16. Our analysis showed alterations in already validated biomarkers at specific ZT’s. Metabolic alterations perceived in AD samples were accompanied by changes in gene expression. Moreover, rate limiting enzymes presented a diurnal variation profile in Non-Tg animals, while 3xTg-AD animals displayed alterations in the circadian pattern of expression in some metabolic genes. Analysis of metabolic fluxes by NMR depicted changes in lipid metabolism, and differences in gluconeogenesis, which were coincident with metabolic alterations seen in type 2 diabetes mellitus, obesity or metabolic syndrome. Finally, analysis of canonical circadian genes revealed an alteration in the diurnal variation of core clock genes in the 3xTg-AD mice. In addition, AD animal model showed alterations in diurnal variation profile of metabolic networks. Those changes correlate with a chronodysfunction at the peripheral level. In suma, in this thesis we show that AD-related pathology in the 3XTg-AD mouse model is linked to cognitive decline (Chapters 4.1 & 4.2) and metabolic alterations in brain and peripheral tissues (Chapter 4.2 & 4.3). In addition, this thesis ends by underpinning an AD-related chronodysfunction, thus raising the question of circadian dysfunction as a culprit for neuropathology.

De modo a manter a homeostasia, os organismos desenvolveram um sistema de relógios moleculares endógenos com vista a antecipar o momento do dia e assim sincronizar vários processos fisiológicos. Um relógio disfuncional pode estar envolvido em várias doenças, incluindo síndrome metabólica e doenças neurológicas. Pacientes com a doença de Alzheimer (AD) exibem ritmos circadianos anormais que precedem o aparecimento de défices cognitivos. Há evidências de que: (i) um relógio disfuncional é responsável por síndromes metabólicas e alterações nos níveis de glucose e de insulina, (ii) insulina afecta os níveis de β-amilóide, um dos péptidos associados com AD e (iii) pacientes com AD possuem uma alteração do relógio circadiano. Alterações no metabolismo, nomeadamente alterações na utilização de energia e no metabolismo da glicose, precedem a deterioração das funções cognitivas. Estas alterações parece ser um dos primeiros sintomas de ADDA. O envelhecimento é acompanhado de um declínio varias funções corporais. O relógio circadiano também perde lentamente o seu ritmo. Este é um processo progressivo e parece ser um derivado do processo de envelhecimento. É importante salientar que muitos desses processos são orquestrados pelo relógio circadiano, que regula temporalmente a homeostase, o ciclo celular, bem como os processos de memória e aprendizagem. O corpo também pode perder a capacidade de controle temporal e de coordenacão e sincronização das funções corporais, tais como o metabolismo em todas as suas diferentes formas, nomeadamente lipidogenesis, adipogênese, metabolismo da glicose e insulina. As repercussões da falta de sincronia dos processos metabólicos são implícitos e parece ser fundamental no aparecimento de doenças neurodegenerativas em que a idade e um factor de risco, tais como DA. O sistema circadiano é um relógio molecular, que consiste de um oscilador responsável pela geração do ritmos biológicos diários. Através de vias de entrada, o ambiente e outros componentes do sistema nervoso enviam informação para o relógio, e também para as rotas de saída, através da qual o oscilador fornece informação temporal para uma grande variedade de processos fisiológicos e comportamentais. Quando as células são removidas e mantidas em uma fatia do cérebro, eles geram ritmos de 24 horas de actividade eléctrica, de secreção e da expressão do gene. A amplitude da actividade eléctrica, a expressão dos genes e a actividade hormona-secretora declina com o envelhecimento cerebral. A dessincronização do relógio circadiano apresenta grandes alterações em todos os sistemas biológicos. Estes incluem mudanças na formação da memória, bem como alterações hormonais e neuroquímicas, com consequências para a neuroplasticidade. O modelo animal triplo transgénico (3xTg-AD) da AD exibe abnormalidades na ritmicidade circadiana que precedem alterações patológicas, tornando este modelo de doença instrumental para investigar a interação entre o relógio circadiano, o metabolismo e as possíveis conexões com a patologia. Sendo assim, este estudo teve como objetivo revelar o impacto de AD nos ritmos biológicos relevantes na patologia, bem como obter uma compreensão mais profunda da fisiopatologia. Inicialmente, este estudo avaliou o impacto do perfil circadiano no desempenho cognitivo em murganhos 3xTg-AD de 24 semanas de idade versus animais controle da mesma idade (Non-TG), explorou também como estas alterações são correlacionadas com a potenciação de longa duração (LTP)no hipocampo e como a função mitocondrial, um indicador do metabolismo cerebral, e alterada pela biologia circadiano. A nossa análise foi realizada no Zeitgeber (ZT) 04 (4 horas após a luz acesa) e ZT 16 (4 horas após a luzes apagadas). A variação diurna, em tarefas de aprendizagem dependentes do hipocampo nos 3xTg-AD e nos Non-Tg foi avaliada. Os resultados do “Morris water maze” (MWM) mostraram que, independentemente da a hora do dia existiam défices cognitivos observáveis nos 3xTg-AD; uma correlação entre ZT e os genótipos só foi possível quando se realizou tarefa de aprendizagem espacial reversa no MWM. Estes resultados sugerem que o padrão de variação circadiana do desempenho da memória depende do tipo de tarefa e o impacto do relógio circadiano em patologia é mais visível em tarefas mais complexas. A amplitude da LTP no hipocampo, uma correlação eletrofisiológica com processos de memória relacionada, ou seja os sinais elétricos, registrados extracelularmente em fibras de Schaffer/CA1 sinapses pirâmide, exibiu um perfil circadiano em animais Non-Tg, o que não foi observado em animais 3xTg-AD. Perturbações na função mitocondrial e do stress oxidativo têm sido implicados na patofisiologia da AD. Por conseguinte, o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) foi medida em sinaptossomas corticais; exposição ao peróxido de hidrogênio (H2O2) revelou aumento de depolarização mitocondrial em ZT 16, sugerindo uma susceptibilidade ZTdependente ao estímulo oxidativo. Simultaneamente, os níveis de cálcio intracelular (ICA) foram medidos, revelando uma incapacidade dos sinaptossomas de 3xTg-AD para manter os níveis iCa ao ZT 16; a exposição a estímulo não mostraram alterações significativas entre ZT's ou genótipos. Os dados sugerem que, quando desafiado / estressado, as mitocôndrias apresentam um comportamento disfuncional no modelo animal de DA. Estes resultados estão de acordo com a hipótese do stress oxidativo na DA. Concluiu-se que, nesta fase, há comprometimento dos ritmos circadianos em características-chave na patogénese da DA; o estudo destaca ainda mais a prevalência de variação diurna e aponta a necessidade de caracterizar melhor a neurobiologia da doença e a integração de ritmos circadianos como uma variável crucial. RMN tem sido largamente utilizado como um método para os estudos longitudinais de metabolitos e vias bioquímicas. Esta técnica permite medir, em condições basais, a via direta (síntese de glicogênio hepático de hexose intacta) e via indireta (síntese de glicogênio hepático do processamento gliconeogênica). A administração de água deuterada (2H2O) leva ao enriquecimento posicional 2H- de glicogénio hepático, tornando o efeito de uma doença (por exemplo, diabetes tipo 2 ou outras intervenções nestes fluxos (dessincronia de ritmos circadianos), acessíveis para avaliação. Com a idade de 6 meses (24 semanas) a patologia em ratinhos 3xTg-AD foi descrito como estando estabelecida. Assim, no segundo capítulo, mostramos que a esta idade o declínio cognitivo, disfunção eletrofisiológico e mitocondrial estavam presentes. Em seguida, perguntamo-nos sobre o ritmo circadiano: estão os ritmos biológicos dessincronizados na DA? Os dados sublinham a relevância dos estudos de variação diurna em patologia. Mostrámos que da prejudica os ritmos biológicos, de forma semelhante a uma dessincronização do ritmo circadiano. Os animais receberam por via intraperitoneal um bolus de 1% 2H2O 24 horas antes de serem euthanaziados e o fígado removido. RNA e metabolitos foram extraídas e analisadas, por qPCR e RMN, respectivamente. As amostras biológicas de 3xTg-AD e ratos Non-Tg foram coletados ao ZT 04 & ZT 16. A análise revelou alterações em biomarcadores já validados em ZT’s específicos. AS alterações metabólicas percebidos em amostras de AD foram acompanhadas por mudanças na expressão gênica. Além disso, as enzimas limitantes apresentam um perfil de variação diurna em animais Non-Tg, enquanto nos animais 3xTg-AD apresentaram alterações no padrão circadiano de expressão em alguns genes metabólicos. Análise de fluxos metabólicos por RMN apresentam alterações no metabolismo lipídico e diferenças na gliconeogênese, que eram coincidentes com alterações metabólicas descritas em diabetes mellitus tipo 2, obesidade ou síndrome metabólica. Finalmente, a análise dos genes circadianos canônicos revelou uma alteração na variação diurna desses genes nos animais 3xTg-AD. Além disso, o modelo animal de DA mostrou alterações no perfil de variação diurna das redes metabólicas. Essas alterações parecem se correlacionar com um cronodisfunção ao nível periférico. Em suma, nesta tese demonstramos que patologia relacionada com a AD no modelo 3XTg-AD está correlacionada com o declínio cognitivo (capítulos 4.1 e 4.2) e alterações metabólicas no cérebro e tecidos periféricos (Capítulo 4.2 e 4.3). Além disso, esta tese termina sustentando um cronodisfunção relacionadas com a AD, sugerindo a questão da disfunção circadiana como um possível culpado para esta neuropatologia.