Induction of different types of cell death by the ether lipid edelfosine in glioblastoma: signalling cross-talk controlling cell death commitment

Abstract

Glioblastoma is the most common and the most aggressive malignant primary brain tumor. The survival rate for this tumor is extremely low because of its aggressiveness, ranging from about 3-4 months without treatment to up to a median survival of about 12-15 months following current medical therapy. Despite very important progresses in the understanding of the molecular pathogenesis of glioblastoma and technological advances in diagnostic and treatment strategies, glioblastomas almost invariably recur near their initial sites rapidly leading to death. A number of survival signalling pathways can be activated constitutively in glioma cells, rendering these cells resistant to conventional chemotherapies and proapoptotic insults.The unfavorable prognosis for glioblastoma patients is also strongly correlated to the intrinsic apoptosis resistance of glioblastoma cells.On these grounds, induction of alternative types of cell death could be an option for the treatment of glioblastoma. Autophagic cell death has been recently considered as an alternative and emerging concept to trigger glioma cell death and to exploit caspase-independent programmed cell death pathways for the development of novel therapies. Edelfosine (ET-18-OCH3) is the prototype molecule of a family of unnatural lipids, collectively known as synthetic alkylphospholipid analogs, which promotes apoptosis in a variety of tumor cells. Edelfosine has been shown to be an effective in vitro and in vivo antitumor drug, acting through the reorganization of membrane domains, termed lipid rafts, as well as through an endoplasmic reticulum stress response, leading to caspase- and mitochondria-mediated apoptosis in different hematological and solid tumor cells. On the first part of this study, we report that edelfosine induces mainly necroptosis in the U118 (U-118 MG) glioblastoma cell line, used as a brain tumor cell line model, whereas apoptosis and autophagy are relatively minor responses. Edelfosine-induced necroptototic response is very rapid and potent, suggesting a putative therapeutic role for necroptosis in brain tumor therapy. On the second part, we describe that inhibition of MEK1/2-ERK1/2 signalling pathway highly potentiates edelfosine-induced apoptosis in glioblastoma U118 cells and switches the type of edelfosine-induced cell death from necrosis to apoptosis. The MEK1/2 inhibitor U0126 alone reduced ERK1/2 phosphorylation, but its effect was further potentiated when used in combination with edelfosine, leading to: RIPK1 degradation, likely underlying inhibition of necroptosis; RelA/NF-κB p65 degradation, thus inhibiting survival signaling; and caspase activation, leading to caspase-dependent apoptosis. The fact that ERK1/2 inhibition dramatically potentiates edelfosine-induced apoptosis in U118 cells, and turns either the survival or necrotic responses into potent apoptosis, suggests that edelfosine is a potent inducer of apoptotic signalling, and that this apoptotic response is highly modulated by ERK1/2 phosphorylation. Next, we explored the impact of the chosen cell death modality in overall survival, and its implications for the development of resistance. When incubated with edelfosine alone, ~20% of the cells remained intact regarding mitochondrial membrane potential (∆Ψm), and did not die through apoptosis or necrosis. These surviving cells expressed Bcl-xL and incubation with the BH3 mimetic inhibitor ABT-737 after edelfosine treatment induced ∆Ψm loss and increased cell death. U0126 preincubation resulted in Bcl-xL degradation with practically all the cells undergoing total ∆Ψm loss and strong caspase-9 activation and apoptosis. Inhibition of ERK phosphorylation changed the type of cell death following edelfosine treatment and favored cell demise. ERK and Bcl-xL inhibition resulted in increased apoptotic rates and decreased survival of resistant cells.Through repeated exposure to edelfosine, we generated a resistant cell line from the sensitive U118 cell line, U118-R, and then performed a comparative analysis of some characteristics in order to gain insight into possible mechanisms of resistance. In the last part of this work, we screened for different types of cell death induced by edelfosine in other glioblastoma cell lines and explored possible ways to increase cell death execution and/or abolish survival signalling, aiming to identify commonly altered pathways where to interfere in order to maximize cell death and avoid drug resistance.This study, with several limitations, brought some contributions to the understanding of decisions in cell death commitment and its implications to cell death resistance, and reinforce the need to further explore the repertoire of antiapoptotic mechanisms in cancer and how survival signalling and cell death blockage contribute to tumor progression, deregulated cell proliferation and resistance to therapies. U118 cells can constitute a useful cell model to elucidate the mechanisms that dictate the cellular decision to undergo alternative cell death pathways, such as apoptosis or necroptosis, as well as the processes mediating the triggering and execution of necroptosis. Unveiling the molecular and regulatory features of the early/primary cell death triggers and initiators, as well as of the switches leading to the different types of cell death, will be of major importance in delineating new approaches to trigger and modulate cell death processes of critical importance in the treatment of tumors, including GBM.

Glioblastoma (GBM) é o tipo de tumor cerebral primário maligno mais comum e também o mais agressivo. O tempo médio de sobrevida dos doentes portadores deste tumor é extremamente baixo devido à agressividade do mesmo, variando entre 3-4 meses sem tratamento e 12-15 meses cumprindo a actual terapêutica de referência. Apesar dos importantes progressos no conhecimento sobre a patogénese molecular do GBM e em tecnologias de diagnóstico e tratamento, os glioblastomas quase invariavelmente recidivam em zonas próximas da localização inicial, conduzindo rapidamente à morte. Várias vias de sobrevivência encontram-se constitutivamente activadas em células de glioblastoma, tornando estas células resistentes à quimioterapia convencional e a estímulos pró-apoptóticos. O prognóstico desfavorável em doentes com GBM está também fortemente correlacionado com a resistência intrínseca das células do tumor à apoptose. Neste campo, a indução de tipos de morte celular alternativos poderia constituir uma opção para o tratamento do GBM. A morte celular autofágica foi recentemente considerada como uma forma alternativa para a indução de morte celular em glioblastoma, tendo este conceito vindo a ser explorado de forma a tirar partido de mecanismos de morte celular programada independente de caspases para o desenvolvimento de novas terapêuticas. A edelfosina (ET-18- OCH3), é a molécula protótipo de uma família de lípidos artificiais conhecidos colectivamente como análogos alquilfosfolípidos sintéticos, que promove apoptose em células de distintos tumores. A edelfosina demonstrou ser um fármaco antitumoral eficaz in vitro e in vivo, actuando através da reorganização de domínios da membrana plasmática denominados lipid rafts, bem como através da resposta de stress do retículo endoplasmático, induzindo apoptose mediada por caspases e mitocôndria em diferentes células de tumores hematológicos e tumores sólidos. Na primeira parte deste estudo, mostramos que a edelfosina induz principalmente necroptose na linha celular de glioblastoma U118 (U118-MG), utilizada como modelo de GBM, enquanto que a apoptose e a autofagia constituem respostas menos significativas para a execução da morte celular. A resposta necroptótica induzida por edelfosina é muito rápida e potente, sugerindo um possível papel terapêutico para a necroptose no tratamento de tumores cerebrais. Numa segunda parte, descrevemos que a inibição da via de sinalização de MEK1/2- ERK1/2 potencia fortemente a apoptose induzida por edelfosina nas células U118 e muda o tipo de morte celular de necrose para apoptose. Isoladamente, o inibidor de MEK1/2 UO126 reduz a fosforilação de ERK1/2 mas os seus efeitos são potenciados quando usado simultaneamente com edelfosina, conduzindo a uma série de eventos: degradação de RIPK1, provavelmente responsável pela inibição da necroptose; degradação de RelA/NF-κB p65, inibindo assim a sinalização de sobrevivência; activação de caspases, conduzindo à execução de apoptose dependente de caspases. O facto de que a inibição de ERK1/2 potencia dramaticamente a apoptose induzida por edelfosina nas células U118 e altera as respostas de sobrevivência ou necroptose para uma potente activação da apoptose, sugere que a edelfosina é um indutor potente de sinalização apoptótica e que a sua regulação é altamente modulada através da fosforilação de ERK1/2. Em seguida, avaliámos o impacto da modalidade de morte executada na sobrevivência celular e as suas implicações para o desenvolvimento de resistência. Quando incubadas com edelfosina, ~20% das células permaneceram intactas no que diz respeito ao potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm), e não morreram nem por apoptose nem por necrose. Estas células sobreviventes expressam Bcl-xL e a sua incubação com o inibidor mimético de BH3 ABT-737 após tratamento com edelfosina resultou na perda de ∆Ψm e no aumento da morte celular. A pré-incubação com U0126 resultou na degradação de Bcl-xL com praticamente todas as células a perderem ∆Ψm e em forte activação de caspase-9 e apoptose. A inibição da fosforilação de ERK alterou o tipo de morte após tratamento com edelfosina, favorecendo a morte celular. A inibição de ERK e de Bcl-xL conduziu a taxas mais altas de apoptose e à diminuição da sobrevivência de células resistentes. Através de exposição repetida à edelfosina gerámos a partir da linha U118 originalmente sensível uma linha celular resistente, U118-R, e fizémos uma análise comparativa de algumas características de forma a tentar compreender melhor possíveis mecanismos de resitência ao fármaco. Na última parte deste trabalho, procuramos caracterizar diferentes tipos de morte celular induzidos pela edelfosina noutras linhas de glioblastoma e explorámos formas de aumentar a execução da morte celular e/ou abolir a sinalização de sobrevivência, tentando identificar vias de sinalização que se encontram mais frequentemente alteradas em GBM, onde interferir de forma a maximizar a morte celular e evitar o desenvolvimento de resistência ao fármaco. Este estudo, apesar das limitações, traz algumas contribuições para a compreensão da “decisão de opção” entre distintos tipos de morte e possíveis implicações dessa decisão para o desenvolvimento de resistência à morte, e reforça a necessidade urgente de explorar detalhadamente o repertório de mecanismos antiapoptóticos no cancro e a forma como a sinalização de sobrevivência e o bloqueio da execução de morte celular contribuem para a progressão tumoral, desregulação da proliferação celular e resistência a terapias. A linha celular U118 pode constituir um modelo útil para ajudar a esclarecer quais os mecanismos que ditam a decisão para a execução de um ou de outro mecanismo de morte, como a apoptose ou a necroptose, e quais os processos que medeiam as fases de triggering e de execução da necroptose. Conhecer as características moleculares de iniciadores e reguladores de morte celular bem como dos “interruptores” que conduzem à execução de distintos tipos de morte será de extrema importância para o estabelecimento de novas formas de activação e modulação de mecanismos de morte essenciais para o tratamento mais eficaz de tumores, incluindo GBM.