Autophagy in the hypothalamus: role of Neuropeptide Y and impact on Synaptic Plasticity

Abstract

O hipotálamo é uma região do cérebro que regula o desenvolvimento, o crescimento e o metabolismo. Recentemente, foi também demonstrado que o hipotálamo desempenha um papel chave no desenvolvimento generalizado do envelhecimento. A autofagia é um processo intracelular envolvido na reciclagem dos constituintes da célula e na manutenção da homeostase celular. Durante o envelhecimento e em doenças associadas ao envelhecimento ocorre diminuição da autofagia. Por outro lado, em diversas espécies de animais, a restrição calórica (RC) é uma robusta intervenção anti-envelhecimento, aumentando o tempo de vida e diminuindo a incidência de doenças associadas à idade. A RC estimula a autofagia e também aumenta os níveis do neuropeptídeo Y (NPY) no hipotálamo. Diversos trabalhos mostram que o NPY tem um papel neuroprotector, aumenta a resistência ao stress. Contudo, o papel do NPY na autofagia nunca foi investigado. Desta forma, o primeiro objectivo deste trabalho foi estudar o papel do NPY na autofagia em neurónios do hipotálamo. Os resultados mostraram que o NPY estimula a autofagia numa linha de neurónios hipotalâmicos de murganho (mHypo-N42) e também em culturas primárias de células hipotalâmicas neurais diferenciadas de rato. O NPY aumentou o fluxo autofágico em neurónios do hipotálamo através da activação dos receptores Y1 ou Y5, e que activam as vias de sinalização intracelular PI3K, ERK e PKA. O efeito do NPY na autofagia num modelo in vivo também foi avaliado, através da sobre-expressão do NPY no núcleo arqueado do hipotálamo de murganhos C57BL/6, pela tecnologia de transferência génica usando vírus adenoassociados. Os resultados mostraram que o NPY também estimula a autofagia no hipotálamo in vivo.

O núcleo arqueado do hipotálamo, responsável pela homeostase energética, é composto por duas populações neuronais distintas – neurónios que expressam POMC e CART, e neurónios que expressam NPY e AgRP. Estas duas populações regulam o anabolismo e catabolismo, recebendo e integrando sinais nutricionais e hormonais da periferia. Estudos recentes sugerem que a plasticidade sináptica dos circuitos hipotalâmicos envolvidos na ingestão alimentar também tem um papel na regulação da homeostase energética. Contudo, o papel da autofagia na plasticidade dos circuitos hipotalâmicos nunca foi investigado. Desta forma, o segundo objectivo deste trabalho foi investigar o papel da inibição específica de uma proteína fundamental do processo de autofagia, a Atg7, na organização sináptica, com uma dieta normal e em privação de alimentos. Os murganhos com inibição específica da proteína Atg7 nos neurónios POMC (POMC-Cre; Atg7loxP/loxP) foram usados como modelo animal de estudo e os murganhos com expressão inalterada de Atg7 (Atg7loxP/loxP mice) como controlos. Nestes animais avaliou-se a organização sináptica dos neurónios POMC. Os animais foram mantidos durante cerca de 10 semanas com acesso livre a uma dieta padrão ou sem acesso a comida durante uma noite. O núcleo arqueado do hipotálamo destes animais foi analisado por microscopia electrónica, microscopia de fluorescência e por microscopia óptica de luz visível. Os neurónios hipotalâmicos POMC dos murganhos POMC-Cre; Atg7loxP/loxP, com ausência de Atg7 nos neurónios hipotalâmicos POMC, apresentaram um aumento da área e do perímetro desses neurónios, e apresentaram acumulação de nematossomas. Além disso, os neurónios hipotalâmicos POMC dos murganhos POMC-Cre; Atg7loxP/loxP apresentaram mais contactos sinápticos, que se traduzem num aumento dos contactos simétricos inibitórios. Depois de uma noite sem acesso a comida, os neurónios do núcleo arqueado do hipotálamo dos murganhos POMC-Cre; Atg7loxP/loxP apresentaram menor imunorreactividade para c-Fos, que sugere menor activação neuronal.

Em conclusão, os resultados desta tese mostram que o NPY induz o fluxo autofágico em neurónios do hipotálamo, e que a autofagia desempenha um papel na regulação da plasticidade sináptica dos neurónios POMC. Uma vez que a autofagia no hipotálamo e os níveis do NPY diminuem com o envelhecimento, a modulação do NPY pode ser um mecanismo protector contra a disfunção hipotalâmica associada ao aumento da idade. Por outro lado, a modulação da autofagia, através de um mecanismo sináptico subjacente, pode oferecer estratégias para a regulação do peso corporal.

The hypothalamus is the brain region that regulates development, growth and metabolism, and has gained increased attention for its key role in the progression of whole body aging. Additionally, autophagy, a highly regulated intracellular process involved in the turnover of most cellular constituents and in the maintenance of cellular homeostasis, is impaired in aging, contributing to the aging phenotype and to the aggravation of age-related diseases. On the other hand, caloric restriction (CR) is a robust anti-aging intervention, increasing lifespan and decreasing the incidence of age-related diseases. CR increases autophagy in different brain areas and increases neuropeptide Y (NPY) levels in the hypothalamus. Moroever, NPY has neuroprotective effects and increases resistance to stress and mean lifespan. However, the role of NPY on autophagy has never investigated before. Therefore, the first aim of this study was to investigate the role of NPY on autophagy in hypothalamic neurons. The results show that NPY stimulated autophagy in mouse hypothalamic cell line N42 (mHypo-N42) and also in rat differentiated hypothalamic neural cell cultures. Moreover, NPY stimulated the autophagic flux in hypothalamic neurons by activating NPY Y1 or Y5 receptors, through PI3K, ERK and PKA intracellular signaling pathways. We also evaluated the role of NPY on autophagy in vivo, by overexpressing NPY in the arcute nucleus (ARC) of hypothalamus of C57BL/6 mice, using adenoassociated viral (AAV) gene transfer technology. The results show that NPY also stimulated autophagy in hypothalamus in vivo.

The hypothalamic ARC, responsible for energy homeostasis, is composed by two major neuronal populations – cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART)/Pro-opiomelanocortin (POMC) expressing neurons and agouti-related peptide (AgRP)/ neuropeptide Y (NPY) expressing neurons. These two neuronal populations regulate anabolic and catabolic state, receiving and integrating peripheral nutritional and hormonal signals. Recent observations suggest that synaptic plasticity in the hypothalamic feeding circuits has also a critical role in regulation of energy homeostasis, since the neuronal synaptic input organization in the hypothalamus is able to adapt and rearrange rapidly in response to metabolic hormones. In addition, autophagy in the hypothalamus was identified as a player in metabolic regulation. However, a role for autophagy in plasticity of hypothalamic feeding circuits has not been explored. Therefore, the second aim of this study was to investigate the role of Atg7 deletion in POMC neurons in the synaptic organization in mice under standard diet and food deprivation. POMC-specific Atg7 knockout mice (POMC-Cre; Atg7loxP/loxP) were used as animal model and Cre-negative Atg7loxP/loxP mice as controls, to evaluate the synaptic organization of the hypothalamic POMC neurons and neuronal activation in hypothalamic ARC. Animals were maintained during 10 weeks with standard diet or overnight fasting, and then brains slices containing arcuate nucleus of the hypothalamus were stained for electron microscopy and for fluorescence and light microscopy. The specific Atg7 deletion in POMC neurons resulted in an increased cell area and perimeter, and nematosomes accumulation. Moreover, we observed that POMC-Cre; Atg7loxP/loxP neurons have more synaptic inputs and more symmetric, putatively inhibitory inputs. After an overnight fasting, POMC-specific Atg7 knockout mice show no normal adaptation to food deprivation, with an impaired neuronal activation in hypothalamic ARC.

Overall, these results show that NPY induces autophagic flux in hypothalamic neurons, and that autophagy has a role in the control of synaptic plasticity of POMC neurons. Since both hypothalamic autophagy and NPY levels decrease with age, modulation of NPY may act as a protective mechanism against impaired hypothalamic dysfunction associated with age. Moreover, autophagy modulation, through underlying synaptic mechanism, might offer strategies to the body weight regulation.