Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/28808
Title: Development and Validation of Analytical Methodologies for the Determination of Antibiotics in Food of Animal Origin for Human Consumption
Authors: Freitas, Andreia Alexandra Ribeiro 
Orientador: Ramos, Fernando Jorge dos
Keywords: Antibióticos; Segurança alimentar
Issue Date: 28-Jul-2015
Citation: FREITAS, Andreia Alexandra Ribeiro - Development and validation of analytical methodologies for the determination of antibiotics in food of animal origin for human consumption. Coimbra : [s.n.], 2015. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/28808
Abstract: O objetivo central desta tese é o de apresentar detalhadamente todo o processo de desenvolvimento e validação de quatro métodos, multi-classe e multi-deteção, para a triagem de antibióticos em leite, músculo de peixe e músculo e fígado de bovino. Recorrendo à ferramenta analítica mais actual, a cromatografia líquida de alta resolução acoplada a um detetor de massa sequencial (UHPLC-MS/MS), os métodos desenvolvidos foram validados de acordo com as especificações da Comissão Europeia, definidas na Decisão da Comissão 2002/657/EC, e destinam-se a ser aplicados na análise de amostras de rotina para o controlo oficial dos produtos alimentares descritos. No primeiro capítulo é apresentada uma revisão bibliográfica sobre os desenvolvimentos analíticos, para a deteção de antibióticos em produtos alimentares de origem animal, por cromatografia liquida. Neste capítulo é salientada a utilização de cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa sequencial como sendo a principal técnica na área da pesquisa de resíduos veterinários em amostras biológicas complexas, devido ao facto de garantir que sejam cumpridos todos os critérios estabelecidos pela Comissão Europeia. São ainda descritos os métodos utilizados para a determinação dos grupos de antibióticos isoladamente, assim como são destacadas as vantagens da utilização de métodos multi-deteção e multi-classe na triagem de antibióticos em amostras de rotina. No entanto, não deixam de ser também referidos os problemas mais relevantes encontrados durante o desenvolvimento dessas metodologias. O segundo capítulo centra-se na descrição dos métodos desenvolvidos, por UHPLC-MS/MS, para leite, músculo de peixe e músculo e fígado de bovino. Entre os antimicrobianos determinados encontram-se sulfonamidas, trimetoprim, tetraciclinas, macrólidos, quinolonas, penicilinas e cloranfenicol. Para todas as matrizes é descrito o processo de otimização da preparação das amostras e deteção dos compostos de interesse, assim como o procedimento de validação de acordo com as diretivas da Comissão Europeia. Um dos principais objetivos da validação dos métodos analíticos é o de demonstrar que os mesmos são de uso apropriado em análises de rotina, o que no presente caso ficou claramente demonstrado. Deste modo, os métodos apresentados, para as matrizes selecionadas, poderão tornar-se ferramentas importantes de utilização na área da Segurança Alimentar com aplicação no plano de monitorização oficial. Finalmente, no terceiro e último capítulo, e tendo em conta os principais problemas encontrados durante a análise de amostras por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa, foram feitos estudos sobre o real impacto do efeito da matriz. Visto que nos métodos desenvolvidos são analisados, simultaneamente, diferentes grupos de compostos, com diferentes propriedades físico-químicas, a especificidade da preparação da amostra tem de ser minimizada. Em espectrometria de massa, esta situação pode levar a que interferentes provenientes da matriz provoquem efeitos de supressão iónica ou aumento do sinal detetado. Estes fenómenos foram estudados por forma a conhecer os reais impactos dos mesmos durante a análise de amostras de rotina. Foi possível concluir que, apesar dos métodos de multi-deteção e multi-classe terem a eficiência necessária para a sua aplicação em triagem, no que respeita à quantificação de compostos detetados, devem ser aplicadas metodologias mais específicas. No entanto, a capacidade de deteção observada para cada método desenvolvido por UHPLC-MS/MS, o baixo custo e curto período de tempo de resposta por amostra, bem como a especificidade para identificar inequivocamente o antimicrobiano presente, são características que comprovam que as metodologias desenvolvidas são ferramentas essenciais a aplicar em Segurança Alimentar.
The main purpose of this thesisis the presentation of the complete process of development and validation of four multi-class and multi-detection screening methods of antibiotics in milk, fish muscle, bovine muscle and bovine liver. Applying the currently analytical tool of choice, ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS), all methods were validated according the European Commission requirements stated in the Commission Decision 2002/657/EC and can be applied in routine analysis of official samples of the target food products. In chapter one, a review on the last developments on the detection of antibiotics in food-producing animals by liquid-chromatography is presented. This chapter highlights the use of liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry detection as the preferred technique in the field of veterinary residues analysis in complex biological samples due to the possibility of fulfil the European Commission criteria. Methods for the individual families of antibiotics are described and emphasized the advantages of using multi-detection and multiclass screening methods in routine analysis. However, the most important problems found while developing those methods are also emphasized. The second chapter presented the developed UHPLC-MS/MS methods for determining sulphonamides, trimethoprim, tetracyclines, macrolides, quinolones, penicillins and chloramphenicol in milk, fish muscle, bovine muscle and bovine liver. For all matrices it is described the process of optimizing sample preparation and detection of target compounds followed by the validation procedure. One of the main goals, successful achieved, of validation is to provided evidence that the methods are suitable for application in routine analysis. With that being proved, the developed screening methods for antibiotics in the target matrices, became important tools in the Food Safety field. Thus the referred methods could be applied by Official Laboratories in the National Residue Monitoring Plan for veterinary medicines, pesticides and contaminants in food of animal origin. Finally, in the third and last chapter, regarding the principal drawback observed when using chromatography coupled with mass spectrometry detection, studies of the real impact of matrix effect in the detection and quantification of the target compounds, were performed. The developed methods can detect, simultaneously, several compounds from different families representing a multitude of diverse physic-chemical properties and, considering that, the specificity of sample preparation had to be minimized. In mass spectrometry that situation can lead to ion suppression or enhancement of signal, owing to interferences coming from the matrices and present in the sample extract to be analysed by mass spectrometry. Such phenomenon was studied in order to understand the real impact in routine analysis. It was concluded that, although multi-detection and multi-class methods can be successfully used for screening purposes, when it comes to quantitation more selective methods should be applied. Despite that, the advantages achieved with the multi-detection UHPC-MS/MS methods turn them in important tools to be used in Food Safety. The capability of detection at residual concentrations, the cost-effectiveness, reduced time of analysis and the specificity to identify the presence of antibiotic in the sample are the features that guarantee the usefulness of the developed methods.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Bromatologia e Hidrologia, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/28808
Rights: openAccess
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