Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/28618
Title: Purines control neuron-glia interaction during neuroinflammation
Authors: George, Jimmy 
Orientador: Cunha, Rodrigo
Amédée, Thierry
Issue Date: 21-Jan-2016
Citation: GEORGE, Jimmy - Purines control neuron-glia interaction during neuroinflammation. Coimbra : [s.n.], 2016. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/28618
Abstract: A neuroinflamação devida à acção de células gliais é uma característica associada aos processos de dano cerebral. No entanto, não é claro se a neuroinflamação occorre em resultado da disfunção das células gliais ou devido a danos nos neurónios. A neuroinflamação resultante de lesões cerebrais é geralmente associada à acção de células da glia. Isto acontece não apenas devido a uma acção directa das células gliais, mas também devido à falta de apoio neurotrófico que normalmente as células da glia fornecem aos neurónios. Assim, o impacto da neuroinflamação sobre os circuitos neuronais pode ser devido ao aumento dos níveis de moléculas mediadoras de inflamação ou devido à falta de suporte neurotrófico. O objectivo principal deste projecto de doutoramento é investigar qual o papel das purinas no controlo das interacções entre células da glia e neurónios. Em particular, e uma vez que a maioria das doenças neurodegenerativas envolve disfunção sináptica, este trabalho centrou-se sobre a acção das purinas no controlo da interacção entre a microglia e a sinapse. Estudos recentes têm mostrado as purinas como candidatas a possiveis mediadores da interacção entre sinapses e microglia em fases iniciais do processo neurodegenerativo. O ATP actua como um sinal de ‘perigo’, activando a microglia. Além disso, as purinas são responsáveis pelo aumento dos níveis de adenosina que ocorre nos estados precoces de neurodegeneração. Os receptores de adenosine A1 e A2A controlam o processamento de informação nos circuitos neuronais. Diversos estudos demonstram que os antagonistas dos receptores A2A têm a capacidade de prevenir alterações sinápticas e preservar a função cerebral em diferentes modelos animais de neurodegeneração. Por outro lado, os receptores A2A têm também a capacidade de controlar diferentes aspectos do processo neurodegenerativo, como a activação e proliferação de microglia, bem como a produção de citoquinas pró-inflamatórias e factores de crescimento como o BDNF. Isto sugere que os receptores A2A desempenham então um duplo papel controlando tanto a activação da microglia como o impacto da neuroinflamação resultante nos neurónios. Este trabalho procurou 1) entender o papel das purinas (ATP e receptor A2A) na função autócrina da microglia e 2) avaliar o papel parácrino da microglia activada (e portanto das purinas) na plasticidade sináptica de curto prazo. O nosso trabalho permitiu descobrir que a estimulação de células da linha celular N9 (microglia) com LPS ou glutamato induziu a libertação de ATP em diferentes concentrações, com níveis reduzidos de ATP em relação à situação controlo no caso do LPS e aumento dos níveis no caso do glutamato. Nós mostramos também que estes níveis de ATP são modulados pela expressão de receptores A2A na células microgliais. Além disso, o ritmo de proliferação da microglia estimulada com LPS ou glutamato é diferente. Experiencias farmacológicas adicionais revelaram uma co-relação inversa entre a libertação de ATP e a proliferação da microglia, sendo ambos os processos modulados por receptores A2A. Para estudar o efeito parácrino desta activação microglial na plasticidade sináptica de curto termo, utilizamos um sistema de dois modelos (um de cultura de células e outro de fatias agudas de cérebro de ratinho). As células microgliais N9 tratadas com LPS foram adicionadas às fatias agudas de hipocampo e as alterações na plasticidade de curto termo foram medidas nas sinapses entre as fibras musgosas e as células piramidais de CA3. Os registos electrofisiológicos na configuração patch-clamp mostraram uma redução na facilitação neuronal (facilitação por frequência e facilitação de pulsos emparelhados) nas fatias agudas tratadas com N9 activadas por LPS. Em experiencias subsequentes, este trabalho mostra 18 ainda que estas formas de facilitação neuronal são moduladas pelos receptores P2X4R e A1, respectivamente. Este estudo mostra também, pela primeira vez, a presença de receptores de P2X4 nas fibras musgosas. Além de tentar compreender o papel dos receptores A2A microgliais na modulação de libertação de ATP pela microglia, este trabalho mostra também que a natureza do sinal de "perigo" (glutamato ou LPS) modifica de forma diferente o metabolismo purinérgico; em especial, a conversão de ATP em adenosina e, subsequentemente, os níveis de proliferação microglial, através do equilíbrio das vias de sinalização do ATP e adenosina, ambos mediados pelos receptores A2A. Esta descoberta chama a atenção para a importância das purinas (especialmente do metabolismo do ATP e adenosina) no mediação dos principais eventos neuroinflamatórios, tais como a proliferação e libertação de ATP microglial. Este trabalho também define um importante papel para as purinas na interacção entre neurónios e células gliais na transmissão sináptica, demonstrando que o efeito do ATP libertado pela microglia e os seus metabolitos (adenosina) sobre os receptores purinérgicos neuronais. A microglia activada por LPS liberta ATP que, por sua vez, age sobre o receptor P2X4 neuronal para reduzir facilitação de frequência. Por outro lado o ATP é convertido em adenosina que por sua vez actua sobre o receptor A1 neuronal para reduzir a facilitação de pulso emparelhado. Esta dupla função das purinas (ATP e adenosina) e dos seus receptores na modulação da plasticidade sináptica curto termo pode permitir compreender melhor a relação entre neurónios e microglia na manutenção da regulação sináptica. O nosso estudo proporciona novas pistas sobre o papel modulador das purinas na regulação das várias funções autócrinas da microglia (proliferação e libertação de ATP) e funções parácrinas correspondentes às interações neurónio - glia em estados semelhantes à neuroinflamação.
Neuroinflammation via glial cells is a feature associated with brain damage. However, whether the involvement of a neuro-inflammatory condition results from dysfunction of glial cells, or by damaged neurons is to be studied. Furthermore, brain damage not only bolsters glial-derived neuroinflammation but also hampers glial-derived neurotrophic support. Thus, the impact on neuronal circuits by neuroinflammation can be due to, either enhanced levels of inflammatory molecules, or low neurotrophic support. The overall aim of this project was to discover the role of purines in controlling neuron-glia interactions, and since most neurodegenerative diseases also involve synaptic dysfunction, this project focused on the role of purines in controlling synapse-microglia interaction. Purines have shown to be promising candidates to mediate the interaction between synapses and microglia in the early phases of neurodegenerative conditions. ATP acts as a ‘danger signal’ and an important activator of microglia. The second major role for purines lies in the increased levels of adenosine that occurs from early stages of neurodegeneration. Adenosine A1 and A2A receptors (A2AR) control information salience in neuronal circuits. Furthermore, studies have shown that A2AR antagonists prevent synaptic modifications, preserving brain function in different animal models of disease. A2AR has also shown to control different features of neuroinflammation, namely microglia activation, proliferation, production of pro-inflammatory cytokines and of growth factors such as BDNF. Generally, this suggests that A2AR plays a dual role in controlling both microglia activation and the feed-forward impact of neuroinflammation on neurons The aim of the project was to: 1) Understand the role of purines (ATP, A2AR) in the autocrine role of activated microglia and 2) To evaluate the paracrine role of activated microglia in short term synaptic plasticity and the role of purines thereof. We found that on stimulation with LPS and Glutamate, N9 microglia cells (cell line of microglia) released ATP at different concentrations (decreased ATP release in case of LPS while increase in case of glutamate, with respect to control). The ATP levels were found to be modulated by A2AR expressed on microglia. Moreover, we observed differences in rate of proliferation between microglia stimulated with LPS and Glutamate. Further pharmacological experiments revealed a co-relation (inverse) between microglial ATP release and microglial proliferation, both of which were modulated by A2A receptors. To study the paracrine effect of this microglial activation on short term synaptic plasticity, we employed a two model system (cell culture and acute slices). LPS treated N9 microglial cells were added onto acute hippocampal slices and changes in short term synaptic plasticity was measured from CA3-mossy fibers. Patch clamp recordings from acute slices with LPS treated N9 microglia showed reduction in both frequency facilitation and paired pulse facilitation, which on further experiments were found to be modulated by P2X4R and A1 receptor respectively. This study also shows for the first time the expression of P2X4 receptors on mossy fibers. We have been successful in demonstrating the role of microglial A2A receptors in modulating the ATP release from microglia. Furthermore, we show that the nature of the “danger” signal (Glutamate and LPS) differently modifies purinergic metabolism (in particular ATP conversion into adenosine) and subsequently formats microglia proliferation, by balancing ATP and adenosine signalling (both governed by A2AR). This finding points out to the importance of purines (especially A2A receptor and that of ATP- 16 adenosine metabolism) in governing key neuro-inflammatory events such as microglial ATP release and proliferation. Moreover our work also defines a role for purines in the interaction between neuron and glia in synaptic transmission, by demonstrating the effect of both microglia derived ATP and its metabolites (adenosine) on neuronal purinergic receptors. LPS treated microglia releases ATP which acts on neuronal P2X4 receptor to reduce frequency facilitation; while the ATP converted adenosine acts on neuronal A1 receptor to reduce paired pulse facilitation. This dual role of purines (ATP and adenosine) and its receptors in modulating short term synaptic plasticity can prove to be beneficial in further understanding the relation between neuron and microglia in maintaining synaptic regulation. Our work is also the first to demonstrate the expression of P2X4 receptors on mossy fibers. Thus, our study provides novel insight into the modulatory role of purines in governing the various autocrine functions of microglia (ATP release and proliferation), and the paracrine functions with respect to neuron-glia interactions in events similar to neuroinflammation.
Description: Tese de doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, no ramo de Neurociências e Doença, apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/28618
Rights: openAccess
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