Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/26587
Title: Leukemia cells modulation by light-activatable nanoparticles
Authors: Boto, Carlos Samuel Marques 
Orientador: Ferreira, Lino
Rocha, Jorge
Keywords: nanoparticulas; leucemia mielóide aguda; nanoparticles; leukemia cells modulation
Issue Date: 23-Jan-2015
Citation: BOTO, Carlos Samuel Marques - Leukemia cells modulation by light-activatable nanoparticles. Coimbra : [s.n.], 2015. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/26587
Abstract: Acute myeloid leukemia (AML) is a group of heterogeneous diseases defined morphologically by an abnormal increase in myeloblasts in the bone marrow (BM). Current therapies include the use of all trans retinoic acid (RA) to induce the differentiation of leukemic cells. Unfortunately, the efficiency of the process is limited, even if coupled with chemotherapy, since patients can relapse after remission (25% of the patients actually die) [1]. This relapse is likely related to an induction of RA-binding protein and increased RA metabolism by cytochrome P-450-mediated reactions. In addition, one-third of patients develop the so-called “RA syndrome” characterized by dyspnea, fever, weight gain and hypotension. In the last years, RA delivery formulations have been proposed to overcome these unwanted effects and some of them evaluated in human clinical trials. A lipossomic RA delivery system has been shown to improve the pharmacokinetic profile of RA as compared to a non-lipossomal formulation and maintained higher and sustained plasma drug concentrations. Further, the liposomal formulation decreased the probability of relapse after remission but not eliminate it. The main goal of this project was to develop a lightactivatable nanoparticle system to improve the intracellular delivery of RA in leukemic cells. The possibility of remotely activating the drug delivery system opens new therapeutic opportunities due to the possibility of activating the differentiation of the cells at the bone marrow niche and potentially interfering with the leukemic stem cell niche. The lightactivatable NPs have approximately 140 nm in diameter, positive net charge, and disassemble when exposed to UV light (365 nm) or blue light (405 nm) releasing RA. These NPs can be taken up rapidly (below 4 h) by acute myeloid leukemia cells (K562, NB4, U937 and AML stem cells). Importantly, our results show that the light activation of NPs contribute for the differentiation of these cells at levels not observed using formulations that release passively RA or by conventional chemotherapy. Light-activated RA+ NPs induce 1.92 (± 0.17) times higher levels of erythroid differentiation in K562, 1.19 (± 0.01) times of myelocytic differentiation in NB4 and 1.45 (± 0.03) times of myelocytic differentiation in U937 cells as compared to non-activated NPs. In addition, light-activated RA+ NPs induce 1.83 (± 0.17) times higher levels of erythroid differentiation in K562, 1.12 (± 0.01) times of myelocytic differentiation in NB4 and 1.44 (± 0.04) times of myelocytic differentiation in Abstract Carlos Samuel Marques Boto xvi – Doctoral Thesis U937 cells as compared to 1 μM RA in solution. It should be noted that RA+ NPs contain ~10 times less RA than the one used in solution. This experimental result is particularly important in the RA-low sensitive cell line U937-PLZF/RARA where the high RA intracellular release is able to overcome the low sensitivity of the cell. Finally, AML stem cells treated with light-activated RA+ NPs showed 69.6 ± 9.2 % and 61.8 ± 10.1 % less colonies, in CFC and LTC-IC colony assays, respectively. Consistent with the in vitro data, CD11b expression was statistical higher in NB4 cells treated with ex vivo and in vivo lightactivated RA+ NPs than in cells treated with RA+ NPs without light activation in the animal experiments. These results indicate that the enhanced intracellular release and the kinetic control mediated by the light triggered-NPs may be an effective strategy to treat leukemia. In summary, we have established an opto-nanomedicine approach for the treatment and study of leukemic stem cells either in vitro or in vivo. This approach allows remote control in the release of biomolecules with spatio-temporal resolution. These light-activatable NPs might be suitable for general therapeutic and regenerative medicine applications.
Leucemia mielóide aguda (AML) é um grupo de doenças heterogéneas definidas morfologicamente por um crescimento anormal do número de mieloblastos na medula óssea (BM). As presentes terapias incluem o uso de ácido retinóico (RA) para induzir a diferenciação de células de leucemia. Infelizmente, a eficiência do processo é limitada, mesmo quando em conjunto com quimioterapia convencional, uma vez que os pacientes sofrem do retorno da doença após remissão (na realidade 25% dos pacientes morrem) [1]. Esta recaída esta provavelmente relacionada com a indução de proteínas de ligação de RA e pelo aumento do metabolismo de RA por reacções mediadas pelo citocromo P-450. Além disso, um terço dos pacientes desenvolvem o designado “síndrome de RA” caracterizado por dispneia, febre, aumento de peso e hipotensão. Nos últimos anos, sistemas de libertação de RA foram propostos para ultrapassar estes efeitos indesejáveis, encontrando-se alguns em ensaios clínicos em humanos. Um sistema de libertação de RA baseado em liposomas demonstrou uma melhoria no perfil farmacológico de RA, em comparação com uma formulação não-liposómica e mostrou ser capaz de manter concentrações de elevadas e sustentadas de droga. Além disso, a formulação liposómica demonstrou a capacidade de diminuir a probabilidade de ocorrência de recaídas, sem no entanto as eliminar. O principal objectivo deste projecto foi o desenvolvimento de uma nanoformulação polimérica fotodissociável para aumentar a entrega intracelular de RA em células de leucemia. A possibilidade de activar de forma remota a libertação controlada de drogas abre novas oportunidades terapêuticas pela possibilidade de activação da diferenciação celular no nicho da medula óssea e potencialmente interferir com o nicho de células estaminais de leucemia. A nanoformulação polimérica fotodissociável tem aproximadamente 140 nm de diâmetro, carga superficial positiva e capacidade de dissociação quando exposta a luz UV (365 nm) ou luz azul (405 nm) libertando RA. Estas NPs são rapidamente internalizadas (períodos inferiores a 4 h) por células de leucemia mielóide aguda (K562, NB4, U937 e células estaminais de AML). Os nossos resultados demonstram que a fotoactivação das nanopartículas contribui para a diferenciação destas células em níveis não observados utilizando nanoformulações que libertam RA de forma passiva ou através de quimioterapia convencional. A activação através de luz das RA+ NPs induz 1.92 (± 0.17) vezes maior Resumo Carlos Samuel Marques Boto xviii – Doctoral Thesis diferenciação eritróide em células K562, 1.19 (± 0.01) vezes diferenciação mielóide em células NB4 e 1.45 (± 0.03) vezes diferenciação mielóide em células U937, quando comparadas com as condições de NPs não activadas com recurso a luz. De igual modo RA+ NPs activadas com luz induzem 1.83 (± 0.17) vezes maior diferenciação eritróide em células K562, 1.12 (± 0.01) vezes diferenciação mielóide em células NB4 e 1.44 (± 0.04) vezes diferenciação mielóide em células U937, quando comparadas com a utilização de 1 μM de RA na solução de cultura. Deve ser salientado que RA+ NPs contêm ~10 vezes menor quantidade de RA do que o utilizado em solução na cultura celular. Estes resultados experimentais são especialmente relevantes no tratamento da linha cellular resistente à acção de RA U937-PLZF/RARA na qual a elevada concentração intracelular de RA consegue induzir diferenciação celular com sucesso. Finalmente, células estaminais de AML tratadas com RA+ NPs activadas com luz apresentam 69.6 ± 9.2 % e 61.8 ± 10.1 % menor número de colónias, na contagem de unidades formadoras de colónias (CFC e LTC-IC), respectivamente. A informação colectada nos ensaios animais demonstrou estar de acordo com a obtida nos ensaios in vitro. A expressão de CD11b foi superior de forma consistente (com relevância estatística) para células NB4 tratadas com RA+ NPs activadas com luz tanto para as condições nas quais a activação pela luz foi realizada ex vivo, como na condição em que esta activação se realizou in vivo. Isto, comparativamente às condições nas quais as células tratadas com RA+ NPs não foram alvo de activação. Estes resultados indiciam que o controlo conferido pela nanoformulação sensível à acção da luz na cinética de libertação intracelular pode ser uma estratégia efectiva para o tratamento de leucemia. Em resumo, foi estabelecida uma abordagem baseada em opto-nanomedicina para o tratamento e estudo de células estaminais de leucemia tanto in vitro como in vivo. Esta estratégia permite o controlo remoto sobre a libertação de biomoléculas com resolução espaço-temporal. Esta formulação fotossensível apresenta grande potencial para aplicação em terapias médicas e medicina regenerativa.
Description: Tese de doutoramento em Engenharia Química, na especialidade de Biotecnologia, apresentada ao Departamento de Engenharia Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/26587
Rights: embargoedAccess
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