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Title: Pathophysiology of Hippocampal CA3 Neurons in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer’s Disease
Authors: Silva, Sílvia Margarida Viana da 
Orientador: Mulle, Christophe
Cunha, Rodrigo
Keywords: Alzheimer; Adenosine; Synapses; Hippocampus
Issue Date: 19-Dec-2014
Citation: SILVA, Sílvia Margarida Viana da - Pathophysiology of hippocampal CA3 neurons in the APP/PS1 mouse model of alzheimer’s disease. Coimbra : [s.n.], 2014. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/26531
Abstract: Alzheimer’s Disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease characterized clinically by progressive memory loss eventually resulting in dementia. Over the course of AD amyloid-beta (Aβ) deposition forms insoluble amyloid plaques but synapse loss is known be better correlated with the progression of the disease. Although the exact role of Aβ is not fully understood, recent evidence suggests that subtle alterations of synaptic transmission precede neuronal degeneration in the AD progression. Early disturbance of synaptic processes involved in learning and memory have been reported in several transgenic mouse models. In particular, the APP/PS1 transgenic mice display contextual memory impairments at 6 months, before accumulation of amyloid plaques. The Dentate Gyrus (DG) and the CA3 regions of the hippocampus are essential for the rapid encoding of contextual memories. Although this brain structure plays a key role in memory formation it has been poorly studied in AD mouse models. Thus, our project aimed to characterize the structural and functional age-dependent deficits of glutamatergic synaptic transmission in hippocampal CA3 pyramidal region. This region represents also an interesting model to study synaptic physiology and dysfunction since CA3 pyramidal cells receive different types of glutamatergic inputs, from dentate granule cells (mossy fibers), from other CA3 pyramidal cells (associative/commissural fibers), and from the entorhinal cortex (perforant path synapses). These inputs differ in terms of the position along the dendrites where they contact CA3 pyramidal cells, their spine structure, their glutamate receptor composition, their presynaptic properties, and the types of synaptic plasticities expressed (short and long term-synaptic plasticity). Combining patch-clamp electrophysiological recordings in acute hippocampal slices with high-resolution fluorescence microscopy of cells infected with new viral tools to study morphological changes we have characterized synapse specific alterations in APP/PS1 mice with 6 months. We found that mossy fiber synapses (Mf) are relatively spared in transgenic animals as compared to associative-comisssural (A/C) synapses both functionally and morphologically. The prominent Mf short-term presynaptic plasticities showed not to be affected at 6 months, and their characteristic presynaptic long-term potentiation (LTP) was also normal. Morphology analysis also revealed no alterations in size of the Mf pre and postsynaptic compartments. There was although an alteration in the complexity of the Mf boutons (presynaptic) that was not matched with a postsynaptic alteration (thorny excrescences, display similar complexity index between genotypes). This result suggests alterations of the filopodia size and/or number, and putative impairments concerning the GABAergic network. In contrast to the lack of presynaptic glutamatergic deficits at Mf synapses, we found a striking loss of NMDA receptor (NMDAR)-dependent long-term plasticity (LTP) at A/C synapses. This loss of LTP was correlated with subtle alterations of the dendritic spine morphology accompanied by a reduced spine density. Importantly, we found that the loss of postsynaptic LTP was not caused by alterations in the amount of synaptic NMDARs, since we found no alteration in NMDAR/AMPAR ratio at A/C synapses. We further exclude alterations in extrasynaptic NMDARs signaling. At the cellular level processes that result in long-term modifications of synaptic strength such as LTP and LTD are thought to be key mechanisms underlying learning and memory. The results we obtained clearly highlight the importance of addressing the role individual synapses play in AD with the capability of spatially separating inputs and the high temporal resolution that just whole-cell patch-clamp recordings can provide. Our results also point out that, in this model, at an early phase of the disease the main synaptic deficits are post-synaptic, and not presynaptic as some of the previous work suggested. Furthermore, our data points out that the chronic deposition of Aβ disturbed LTP without altering NMDARs conductance (synaptically and extrasynaptically), suggesting that the loss of LTP might be due to alterations in intracellular mechanisms downstream NMDARs. A2A receptors (A2ARs) and metabotropic glutamate receptors 5 (mGluR5) are known to modulate NMDAR signaling and reported to be important targets for AD treatment. Furthermore, both caffeine (antagonist of A2AR) and MTEP (antagonist of mGluR5) have been reported to rescue behavioural deficits in AD mice models. We found that short application of both these drugs resulted in a partial rescue of the LTP levels in the A/C synapses of APP/PS1 animals. Our study provides novel insight into the mechanisms of early AD, examines the cellular deficits underlying learning and memory impairment and explores promising drugs for their potential to reverse those cellular deficits.
A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa que, do ponto de vista clínico, é caracterizada inicialmente pela perda da memória de curto prazo que conduz, irreversivelmente, a perda progressiva de capacidades cognitivas. No curso da DA há acumulação de péptidos β-amilóides (Aβ) que formam depósitos insolúveis denominados placas amilóides. A evidência disponível indica que o início da deterioração da memória observada na DA é devido a alterações na função sináptica e não à acumulação de placas amilóides ou à perda de neurónios. Contudo, o mecanismo de ação pelo qual os péptidos Aβ levam à alteração da transmissão sináptica não é completamente conhecido. Ratinhos transgénicos, que apresentam uma elevada taxa de produção de Aβ, têm sido utilizados como modelos da DA, dado que sofrem uma degradação progressiva da função cognitiva. Em particular, o ratinho transgénico APP/PS1 apresenta uma deterioração da memória de trabalho que tem início antes de formação das placas amilóides. A comunicação entre o giro dentado (GD) e a região CA3 do hipocampo, feita através dos axónios das células granulares do GD, é essencial para este tipo de memória. Também a comunicação sináptica entre os neurónios piramidais de CA3 é fundamental no processamento da informação no hipocampo, em particular no que respeita à implementação de novas memórias. O objetivo principal do trabalho desenvolvido nesta dissertação de doutoramento foi a caracterização das alterações estruturais e funcionais das sinapses glutamatérgicas na região CA3 de ratinhos transgénicos APP/PS1. Esta região do hipocampo, apesar do seu papel na formação de traços mnemónicos, tem sido muito pouco estudada em modelos animais da DA. Além disso, os circuitos neuronais de CA3 são modelos interessantes no estudo da transmissão e plasticidade sináptica pois os neurónios de CA3 recebem vários tipos de aferentes glutamatérgicos: das fibras musgosas (Mf) provenientes do GD; das fibras associativas/comissurais (A/C) provenientes de outros neurónios de CA3; das fibras da via perfurante (PP) diretamente do córtex entorrinal. Estes três aferentes apresentam diferenças importantes em termos de localização dos seus terminais nervosos ao longo da árvore dendrítica, mas também em termos de morfologia da espinha dendrítica, da composição de recetores de glutamato e das propriedades de plasticidade sináptica de curto e longo termo prazo. Através de estudos de electrofisiologia e de imagiologia confocal de super-resolução, procedeu-se à caracterização de alterações de vários destes parâmetros nos ratinhos APP/PS1 que modelam a DA. Este estudo permitiu identificar que, em ratinhos APP/PS1 com 6 meses de idade, as sinapses das Mf estão relativamente preservadas em termos de alterações fisiológicas e morfológicas, em comparação com as sinapses A/C. Diferentes protocolos de estimulação pré-sináptica mostraram que a plasticidade sináptica característica das Mf não sofreu alterações. Em linha com estes resultados não se registaram também alterações no volume ou na área dos terminais pré-sinápticos ou componentes pós-sinápticos. Contudo, observou-se uma alteração no índice de complexidade dos terminais pré-sinápticos, sem alterações pós-sinápticas, que pode ser indicativa de alterações no número ou tamanho dos contactos (filopodia) com interneurónios GABAérgicos. Em contaste com a ausência de défices na comunicação glutamatérgica nas Mf, observou-se uma total perda da capacidade de potenciação de longa duração (LTP) nas sinapses A/C. Esta alteração electrofisiológica foi acompanhada por uma subtil alteração da densidade sináptica, mas sem modificações morfológicas de relevo. Surpreendentemente, concluiu-se que esta perda de LTP não é devida a alterações no número ou nas características dos recetores de glutamato presentes na membrana, uma vez que os rácios de recetores AMPA e NMDA na sinapse não se encontravam alterados. Também o número e/ou condutância dos recetores NMDA extrasinápticos, importantes para a plasticidade sináptica, não estava alterado neste modelo de AD. As modificações da plasticidade sináptica como LTP e LTD (depressão de longa duração) são considerados os principais mecanismos neurofisiológicos que estão na base da aprendizagem e memória. Os resultados obtidos neste estudo ilustram o potencial e a importância que a investigação de sinapses individuais, através de técnicas de patch-clamp, oferece para compreender os mecanismos da DA, com vista a melhorar as terapêuticas disponíveis. Por exemplo, no modelo de DA utilisado neste estudo, a produção anormal de péptidos Aβ causou défices sinápticos que foram maioritariamente pós-sinápticos, sendo estas alterações independentes do número ou da composição molecular dos recetores NMDA. Estes dados sugerem que a perda de LTP se deve à alteração de mecanismos intracelulares de controlo dos recetores NMDA e não a defeitos na sua ativação. Os receptores de adenosina A2A e os receptores metabotrópicos de glutamato do tipo 5 (mGluR5) tem a capacidade de modular processos de plasticidade sináptica dependentes de recetores NMDA. Estes recetores A2A e mGluR5 estão presentes na membrana pós-sináptica de várias sinapses do hipocampo, sendo ambos alvo de fármacos (cafeína, antagonista de receptores A2A e MTEP, antagonista de mGluR5) responsáveis pela atenuação de sintomas da DA em diversos modelos animais da DA. Conformemente, observou-se que uma curta incubação de fatias de cérebro de ratinhos APP/PS1 com um antagonista de recetores A2A ou de recetores mGluR5 foi suficiente para recuperar parcialmente os níveis de LTP registados nas sinapses A/C. Em conclusão, ao analisar as células de CA3, este estudo permitiu detalhar alterações sinápticas que estão subjacentes à aprendizagem e memória, bem como documentar efeitos sinápticos de fármacos capazes de reverter os sintomas da DA.
Description: Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Ciências Biomédicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/26531
Rights: embargoedAccess
Appears in Collections:FMUC Medicina - Teses de Doutoramento

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