Carcinoma hepatocelular : estudo clínico, caracterização bioquímica e marcadores de rastreio e diagnósticoTese de doutoramento

Abstract

Introdução e objectivos Na Europa, em 2008, houve cerca de 65.000 casos de carcinoma hepatocelular (CHC), com 60.240 mortes, estimando-se que em 2020 se atinjam 78.000 casos. Em Portugal, a incidência é de 3,5/100.000 nos homens e de 1,2/100.000 nas mulheres (GLOBOCAN, 2008) e os internamentos por CHC praticamente triplicaram entre 1993 e 2005, tendo o número de mortes quase duplicado de 1990 para 2004. Perante estes números e a manutenção de um prognóstico tão sombrio, pretendemos, partindo da experiência clínica, contribuir para o conhecimento acerca do CHC, especialmente no que se refere ao estadiamento e terapêutica e ao diagnóstico precoce (que pressupõe vigilância e capacidade de detecção e caracterização de nódulos hepáticos). Material e métodos Planeámos um trabalho constituído por três partes: 1) Estudo clínico, baseado na análise retro-prospectiva de doentes com CHC (epidemiologia, métodos de diagnóstico, estadiamento, tratamento), sendo para esse efeito desenvolvido software para o registo e a monitorização dos doentes; 2) Estudo das características bioquímicas (metabolómicas) do CHC e do tecido adjacente (controlo negativo), por espectroscopia de RMN 1H, sendo os espectros adquiridos num Espectrómetro Bruker Avance DRX-500, visando detectar e caracterizar alterações metabólicas do CHC, como ponto de partida para a obtenção de marcadores com potencial valor diagnóstico; 3) Estudo de marcadores serológicos de rastreio e diagnóstico do CHC, testando o papel da osteopontina (OPN) plasmática (por ELISA) no contexto da cirrose alcoólica, comparando-a com a alfafetoproteina (AFP) sérica (IMMULITE 2000 AFP, quimioluminescência). Resultados 1) Foram incluídos no estudo clínico 165 doentes (H:133; M:32), com idade média de 64,7 anos (20-93), 90,3% com cirrose hepática. A ingestão excessiva de álcool foi referida por 122 indivíduos (73,9%), que isoladamente ou associada à diabetes mellitus tipo 2 e/ou à obesidade foi responsável por 59% dos factores de risco identificados. Os vírus hepatotrópicos foram detectados em 26% dos casos, em metade deles associados ao álcool. O CHC foi diagnosticado após sintomas em 57,6% dos casos e em rastreio em 31,5%. Na classificação BCLC, aquando do diagnóstico, 32,7% estavam no estádio C, 23,6% no B, 22,4% no D e 19,4% nos estádios 0 e A. A sobrevivência global mediana foi de 364 dias (desvio absoluto: 337 dias); a probabilidade de sobrevivência a 1 e a 3 anos foi de, respectivamente, 63,9% e 48,2%; a probabilidade de sobrevivência a 1 ano para os estádios A, B, C e D foi, respectivamente, de 89,9%, 86,3%, 43,4% e 33,3%. No estádio C, encontrámos 2 grupos com sobrevivências diferentes. Tratámos 48 doentes (estádio C) com sorafenib: sobrevivência média estimada de 11,89 meses (IC 95%: 6,46–17,32); efeitos secundários na maioria dos doentes, mais frequentes os gastrointestinais (n=86), dermatológicos (n=47) e constitucionais (n=28), quase sempre de grau 1 ou 2 do CTCAE. 2) Foram analisadas por espectroscopia 16 amostras de tecido hepático (8 de CHC e 8 de tecido envolvente) e também os extractos aquosos e lipídicos dos tumores e tecido não tumoral; obtiveram-se espectros de RMN de boa qualidade para tecido e para os extratos. Nos extratos aquosos registaram-se valores mais baixos de glicose e creatinina nos tumores, com diferença significativa, havendo ainda aumento de colina e lactato, embora não estatisticamente significativo. 3) No estudo sobre o papel da OPN foram incluídos 90 doentes com cirrose alcoólica, 45 sem CHC (Grupo I) e 45 com CHC (Grupo II); a distribuição pelas classes de Child-Pugh era ligeiramente diferente entre os grupos (p=0,052), sendo semelhantes quanto ao score MELD (p=0,205); relativamente ao estádio BCLC, no Grupo II, 4,4% estavam no 0, 42,2% no A, 24,4% no B, 15,6% no C e 13,3% no D. A mediana da AFP no Grupo I foi de 3,00 (0,90-17,00) ng/mL e no Grupo II de 11 (1,30-431272,00) ng/mL (p<0,001); a mediana da OPN foi de 923,80 (193,80-2786,20) e de 946,30 (337,10-3583,00), respectivamente para os Grupos I e II, sem diferença significativa (p=0,826), o mesmo acontecendo quando se comparou o Grupo I com estádios precoces (0 e A) do Grupo II (p=0,353). Verificou-se correlação positiva da OPN com o score de Child-Pugh (ρ= 0,533; p<0,001) nos dois grupos; a OPN (ρ=0,428; p=0,003) e a AFP (ρ=0,522; p< 0,001) apresentaram correlação positiva com o estádio BCLC. A análise da área sob a curva ROC para a AFP permitiu estabelecer um valor de corte de 8,2 ng/mL para sensibilidade de 57,8% e especificidade de 93,3%; aumentando o valor de corte para 23,5 ng/mL eleva-se a especificidade para 100%, mas diminui-se a sensibilidade (42,2%); a análise da curva ROC para a OPN não permitiu estabelecer um valor de corte capaz de distinguir os 2 grupos.

Conclusões 1) A cirrose alcoólica é, de longe, o principal factor causal de CHC, associando-se com frequência a outros (diabetes, obesidade, vírus). O diagnóstico continua a ser feito tardiamente na maioria dos casos, devendo insistir-se na importância da vigilância dos doentes em risco. Foi significativamente maior a sobrevivência dos doentes em estádios precoces, o que estará relacionado com a eficácia da terapêutica. Identificámos dois grupos distintos no estádio C, quanto à sobrevivência, tendo como base um conjunto de variáveis, de que se destacam a PS, a ascite, a albuminemia e o número de nódulos. O sorafenib foi uma terapêutica útil em doentes do estádio C, Child-Pugh A. 2) São promissores os resultados do estudo da metabolómica tumoral, entreabrindo uma porta que pode levar a formas simples e eficazes de diagnóstico precoce, ainda que com a limitação da acessibilidade actual da tecnologia que empregámos. 3) A OPN não mostrou qualquer utilidade no diagnóstico do CHC enxertado em cirrose alcoólica, mas poderá ter algum interesse como factor de prognóstico, uma vez que se correlaciona com a gravidade da doença de base.

Introduction and objectives In Europe, in 2008, there were about 65,000 cases of hepatocellular carcinoma (HCC), with 60,240 deaths and it is estimated that by 2020, 78,000 cases will be reached. In Portugal, the incidence is 3.5/100,000 in men and 1.2/100,000 in women (GLOBOCAN 2008) and admissions for HCC nearly tripled between 1993 and 2005, having the number of deaths almost doubled, from 1990 to 2004. Facing these numbers and the maintenance of such a grim prognosis, we intend, with the contribution of our clinical experience, to promote the knowledge of HCC, mainly in which concerns to staging, treatment and early diagnosis (which requires surveillance, detection and characterization of liver nodules).

Material and methods Our work-plan consisted of three parts: 1) Clinical study based on retro-prospective analysis of patients with HCC (epidemiology, methods of diagnosis, staging, treatment); software was developed for this purpose, in order to record and monitor patients; 2) Study of the biochemical characteristics (metabolomics) of HCC and adjacent tissue (negative control) by 1H NMR spectroscopy; spectra were acquired on a Bruker Avance DRX-500, to detect and characterize metabolic changes of HCC, as a starting point for obtaining markers with potential diagnostic value; 3) Study of serological markers for HCC screening and diagnosis, testing the role of plasma (ELISA) osteopontin (OPN) in alcoholic cirrhosis, comparing it with alpha-fetoprotein (AFP) serum levels (IMMULITE 2000 AFP, chemiluminescence).

Results 1) 165 patients (M: 133, W: 32), with a mean age 64.7 years (20-93), were included in the clinical study, 90.3% with liver cirrhosis. Excessive alcohol intake was reported by 122 individuals (73.9%) and, alone or associated with type 2 diabetes mellitus and/or obesity, was responsible for 59% of the identified risk factors. Hepatotropic viruses were detected in 26% of the cases, in half of them associated with alcohol. HCC was diagnosed due to symptoms in 57.6% of cases and 31.5% in screening. According to BCLC classification, at diagnosis 32.7% were in stage C, 23.6% in B, 22.4% in D and 19.4% in stages 0 and A. The median overall survival was 364 days (absolute deviation: 337 days); the probability of survival at 1 and 3 years was, respectively, 63.9% and 48.2%; the probability of survival at 1 year for stages A, B, C and D was respectively 89.9%, 86.3%, 43.4% and 33.3%. In stage C, we found 2 groups with different survivals. We treated, with sorafenib, 48 stage C patients with estimated median survival of 11.89 months (95% CI: 6.46 to 17.32); more frequent adverse events were gastrointestinal (n=86), dermatological (n=47) and constitutional (n=28), mostly grade 1 or 2 CTCAE. 2) Sixteen samples of liver tissue (8 HCC and 8 surrounding tissue) as well as aqueous and lipid extracts from tumor and non-tumor tissue were analyzed by spectroscopy; NMR spectra of good quality were obtained for intact tissue and extracts. Lower values of glucose and creatinine in aqueous extracts were recorded, with a significant difference to the non-tumor tissue; choline and lactate were increased in tumors, although without statistically significant difference. 3) The study on the role of OPN included 90 patients with alcoholic cirrhosis, 45 without HCC (Group I) and 45 with HCC (Group II); there was a slightly different distribution among Child-Pugh classes between groups (p=0.052), being MELD score similar (p=0.205); Group II BCLC stage distribution: 4.4% were at 0, 42.2% in A, B in 24.4%, 15.6% in C and 13.3% in D. The median AFP in group I was 3.00 (0.90 to 17.00) ng / mL and 11 in Group II (1.30 to 431,272.00) ng/mL (p<0.001); the median of OPN was 923.80 (193.80 to 2786.20) and 946.30 (337.10 to 3583.00), respectively, for Groups I and II, showing no significant difference (p=0.826); the same is true when comparing group I with early stages (0 and A) of Group II (p=0.353). There was a positive correlation between OPN and Child-Pugh score (ρ=0.533, p<0.001) in both groups; OPN (ρ=0.428, p=0.003) and AFP (ρ=0.522, p<0.001) positively correlated with BCLC stage. The analysis of the area under the ROC curve for AFP allowed to establish a cutoff value of 8.2 ng/mL with 57.8% sensitivity and 93.3% specificity; increasing the cutoff to 23.5 ng/mL increases specificity to 100%, but decreases sensitivity to 42.2%; the ROC curve analysis for OPN did not allow to establisha cutoff able to distinguish the 2 groups.

Conclusions 1) Alcoholic cirrhosis is by far the main causal factor of HCC, often associated with other (diabetes, obesity, viruses). The HCC diagnosis is done very late in most of the cases, and we should insist on the importance of surveillance of patients at risk. Patient survival was significantly higher in early stages, related to the effectiveness of the therapy. We identified two distinct groups in stage C, in terms of survival, based on a set of variables: PS, ascites, albumin concentrations and the number of tumor nodules. Sorafenib was a useful therapy in patients in stage C, Child-Pugh A. 2) The tumor metabolomics study results are promising, opening a door that can lead to simple and effective ways of early diagnosis, althought with the limitation of the current accessibility of the technology that we employed. 3) OPN has not shown any usefulness in the diagnosis of HCC in alcoholic cirrhotic patients, but may be of some interest as prognostic factor, since it correlated with the severity of the underlying disease.