Mecanismos patológicos e prevenção farmacológica da carcinogénese urotelial: estudo experimental

Abstract

Introdução: O carcinoma da bexiga é um dos tumores mais prevalentes no Mundo Ocidental. A natureza recidivante das suas formas não músculo-invasivas, que constituem 75 a 80% de todos os tumores, associada à frequente progressão a formas invasivas e agressivas, tornam-no num dos cancros com mais elevados custos pessoais, sociais e financeiros. Várias características fazem dele um tumor adequado para a adopção de estratégias de quimioprevenção mas, apesar dos resultados promissores de várias substâncias, nenhum estudo cientificamente sólido permite, de momento, recomendar o seu uso. Objectivos: Os objectivos principais desta dissertação foram: 1. Aprofundar o conhecimento fisiopatológico da carcinogénese vesical; 2. Avaliar a capacidade de quimioprevenção de alguns fármacos de uso corrente em diversas patologias relativamente frequentes através da utilização de um modelo experimental; 3. Caracterizar os putativos mecanismos de acção anticancerígena desses fármacos. Materiais e Métodos: Foram utilizados ratos Wistar machos num modelo experimental de carcinogénese vesical, dividido em duas fases: 1. Administração do carcinogénio BBN 0,05% na água da bebida, entre as semanas um e oito, para indução tumoral; 2. Sem administração de BBN, entre as semanas nove e vinte, para manifestação das lesões tumorais. Os fármacos e doses (mg/kg/dia) em estudo foram os seguintes: Imunomoduladores (Sirolimus 1 e 2; Ciclosporina 5); Inibidores da COX-2 (Celecoxib 1 e 10; AAS 25 e 250); Fármacos com “Acções Pleiotrópicas” (Atorvastatina 3 e 30; Ácidos gordos Ómega-3 600). Formaram-se vários grupos: Controlo (C): sem administração de BBN ou fármacos; Carcinogénio (BBN): BBN entre as semanas um e oito, sem fármacos; Controlo do Fármaco: administração do fármaco na fase 1 ou fase 2, sem BBN; Prevenção Precoce: BBN e fármaco entre as semanas um e oito; Prevenção Tardia: BBN entre as semanas um e oito; fármaco entre as semanas nove e vinte. No final da 20.ª semana os animais foram sacrificados. Foi colhida a bexiga para estudo histopatológico, imunohistoquímico e de expressão génica. Foi colhido sangue para hemograma, alguns parâmetros bioquímicos, marcadores séricos e de equilíbrio oxidativo. Foram avaliados o bem-estar e a segurança animal. Resultados: No grupo Carcinogénio a incidência de neoplasias uroteliais foi de 68%, lesões maioritariamente papilares e exofíticas, de dimensões variáveis. A histopatologia mostrou hiperplasia urotelial em 100% das bexigas, displasia de alto grau em 96% e Cis em 52%. Dos carcinomas, quatro eram TPBPM, 11 de baixo grau e 10 de alto grau histológico. A marcação imunohistoquímica de p53, Ki67 e CD31 nas lesões pré-malignas ou malignas foi mais acentuada e extensa. A expressão génica de p53, Bcl-2, Hras, Cox-2 e VEGF foi superior à do grupo Controlo, ao contrário do gene Rb1. Também se verificou uma elevação de TGF-β, TNF-α e de marcadores inflamatórios. A utilização de Sirolimus na primeira fase do estudo, na dose de 1 e de 2 mg/kg/dia, levou a um aumento da incidência tumoral para 75% e 80%, respectivamente. Ao invés, a administração de Sirolimus 2 mg/kg/dia a partir da 9.ª semana levou a um decréscimo para 37,5%, associada a redução do número e volume tumoral, das lesões pré-neoplásicas, diminuição de TGF-β e um perfil oxidativo mais favorável. Relativamente à Ciclosporina A, a incidência tumoral de 62,5% na sua utilização precoce e de 50% na mais tardia não diferiu de forma significativa da do grupo carcinogénio, apesar da redução do número e volume tumoral e de algumas lesões hiperplásicas, displásicas e papilares. O Celecoxib na primeira fase do estudo, nas doses de 1 e 10 mg/kg/dia, levou a uma menor incidência (12,5%), número e volume tumoral. A utilização do fármaco na segunda fase não trouxe qualquer benefício. Quanto ao AAS, usado apenas na primeira fase, a dose de mais alta teve uma redução mais significativa na incidência de neoplasias (12,5 vs 37,5%) e também no número e volume tumoral. Houve ainda uma redução das lesões uroteliais hiperplásicas, pré-neoplásicas e da agressividade dos carcinomas, de TGF-β e dos marcadores inflamatórios. A Atorvastatina, usada nas primeiras oito semanas, reduziu a incidência de carcinomas para 12,5% na dose de 3 mg/kg/dia e para 25% na dose de 30 mg/kg/dia, bem como do número, do volume e da agressividade histológica. Apesar da diminuição da displasia de alto grau e do Cis com os Ácidos gordos Ómega 3 na primeira fase do modelo carcinogénico, tal não se traduziu numa menor incidência de carcinomas (62,5%) ou do número de tumores, mas apenas numa redução dos volumes. Houve com estes dois fármacos uma diminuição dos marcadores inflamatórios e um perfil oxidativo mais favorável. Nos grupos em que foi conseguida a quimioprevenção tumoral, as investigações complementares mostraram uma marcação imunohistoquímica para p53, Ki67, CD31 e Cox-2 (nos inibidores da Cox) mais localizada e ligeira e nos estudos de expressão génica houve uma menor expressão de proto-oncogenes e de genes anti-apoptose. Conclusões: A incidência de carcinoma urotelial no nosso modelo foi de 68%. A carcinogénese vesical, que reproduz a verificada no humano, incluiu desregulação do ciclo e da proliferação celular, da imunovigilância tumoral, inibição da apoptose, aumento da angiogénese e uma acção pró-inflamatória. Os inibidores selectivos e não selectivos da Cox-2 e a Atorvastatina foram os fármacos que demonstraram maior eficácia. Com excepção do Sirolimus, a prevenção farmacológica do carcinoma da bexiga foi mais eficaz quando instituída precocemente. A prevenção neoplásica deveu-se à conjugação de múltiplos mecanismos de acção farmacológica, que permitiram o reequilíbrio das vias alteradas do processo carcinogénico.

Introduction: Bladder cancer is one of the most prevalent tumours in the Western World. The recurrent nature of its non-muscle invasive forms, which are 75 to 80% of all bladder tumours, together with the frequent progression to invasive and more aggressive neoplasms, makes it one of the cancers with the highest personal, social and financial costs. Several characteristics make it suitable for the adoption of chemoprevention strategies but, despite the promising results of several substances, no scientifically relevant study currently recommends their use. Objectives: The main objectives of this work were: 1. To improve the knowledge of the pathophysiology of bladder carcinogenesis; 2. To evaluate the chemopreventive capacity of some agents currently used, in an experimental model; 3. To characterize the putative anticancer mechanisms of action of these drugs. Materials and Methods: Male Wistar rats were used in an experimental model of bladder carcinogenesis divided into two phases: 1. Administration of the carcinogen BBN 0.05% in the drinking water for tumour induction, between weeks one and eight; 2. No administration of BBN, between weeks nine and twenty, for the manifestation of tumour lesions. The drugs and doses (mg/kg/day) in study were immunomodulators (Sirolimus 1 and 2; Cyclosporin 5), COX-2 inhibitors (Celecoxib 1 and 10, ASA 25 and 250), drugs with "pleiotropic actions" (Atorvastatin 3 and 30; Omega-3 fatty acids 600), divided in several groups: Control (C): no BBN or drug administration; Carcinogen (BBN): BBN between weeks one and eight, no drug; Drug Control: administration of drug in the first or second phase without BBN; Early Prevention: BBN and drug between weeks one and eight; Late Prevention: BBN between weeks one and eight and drug between weeks nine and twenty. At the end of week 20 the animals were sacrificed. The bladder was harvested for histopathological, immunohistochemical and gene expression studies. Blood for CBC, some biochemical parameters and serum markers of oxidative balance was collected. Welfare and animal safety were evaluated. Results: In the Carcinogen group the incidence of urothelial cancer was 68%, mostly papillary and exophytic lesions of variable dimensions. Histopathology showed urothelial hyperplasia in 100% of the bladders, high-grade dysplasia in 96% and Cis in 52%. Four of the neoplasms were PNLMP, 11 low grade and 10 high grade carcinomas. The immunohistochemical staining for p53, Ki67 and CD31 in premalignant and malignant lesions was more pronounced and extensive. The gene expression for p53, Bcl-2, HRAS, COX-2 and VEGF was higher than in the control group unlike the Rb1 gene. An increase of TGF-β, TNF-α and inflammatory markers was also seen. The use of Sirolimus in the first phase of the study, at a dose of 1 and 2 mg/kg/day led to an increase in tumour incidence to 75% and 80%, respectively. On the contrary, the administration of Sirolimus 2 mg/kg/day after week nine lowered the incidence to 37.5% together with a reduction in the volume and tumour number, of pre-neoplastic lesions, TGF-β and a more favourable oxidative profile. Regarding Cyclosporin A, tumour incidence of 62.5% in its early use and 50% in the later did not differ significantly from the Carcinogen group, despite a reduction in tumour number and volume and some hyperplastic, dysplastic papillary lesions. The use of Celecoxib in the first phase of the study, 1 and 10 mg/kg/day resulted in a lower incidence (12.5%), tumor volume and number. Its use in the second stage did not bring any benefit. As for ASA, used in the first phase, the highest dose had a greater reduction in the incidence of cancers (12.5 vs 37.5%) and also in tumor volume and number. There was also a reduction in hyperplastic and preneoplastic urothelial lesions, and in the aggressiveness of carcinomas, TGF-β and inflammatory markers. Atorvastatin, used in the first eight weeks, reduced the incidence of carcinomas to 12.5% at a dose of 3 mg/kg/day and to 25% at a dose of 30 mg/kg/day, and also their number, volume and histological aggressiveness. Despite the reduction in high-grade dysplasia and Cis with Omega 3 fatty acids in the first phase of the carcinogenic model, a lower incidence of carcinomas (62.5%) or number of tumours were not achieved, although a reduction in tumoral volumes was obtained. With these two drugs there was a decline of inflammatory markers and a more favorable oxidative profile. In the groups in which chemoprevention was achieved, immunohistochemical staining for p53, Ki67, CD31 and Cox-2 was more localized and less intense. There was less expression of protooncogenes and anti-apoptotic genes. Conclusions: The incidence of urothelial carcinoma in our model was 68%. The bladder carcinogenesis pathway includes an imbalance of the cell cycle and proliferation, inhibition of apoptosis, increased angiogenesis, disruption of tumor immunosurveillance and a proinflammatory state. COX-2 inhibitors (both selective and non-selective) and atorvastatin have shown the greatest efficacy among the studied drugs. With the exception of Sirolimus, pharmacological prevention of bladder carcinoma was more effective when started earlier. Neoplastic prevention was due to the combination of multiple mechanisms of pharmacological action, which allowed the rebalancing of altered pathways in the carcinogenic process.