DNA-Polyethylenimine-Fe(III) complexes for gene delivery. A combined Monte Carlo and experimental study

Abstract

A terapia génica apresenta excelentes oportunidades médicas para o tratamento de várias doenças graves, incluindo o cancro. Nas últimas décadas, um grande esforço tem sido realizado para desenvolver vetores não-virais biocompatíveis com capacidade de superar as diversas barreiras biológicas. Esta tarefa torna-se bastante exigente, na medida em que este vetor tem de ser suficientemente versátil para se adaptar às condições adversas, e por vezes contraditórias que encontrará ao longo do seu percurso através da célula. Polímeros naturais e sintéticos têm sido amplamente utilizados e são reconhecidos como vetores eficientes para a administração do gene. Entre todos, a polietilenimina (PEI) tem-se destacado pelo seu elevado desempenho. No entanto, a utilização deste policatião tem que ser moderada devido a sua elevada toxicidade. O principal objetivo do presente trabalho é a utilização de um segundo agente que apresente concomitantemente, capacidade como agente de condensação e ainda capacidade de modular as propriedades do complexo de ADN-PEI. O Fe(III) foi o metal selecionado devido ao seu papel crucial em organismos vivos, o que consequentemente, faz com que seja um composto relativamente inerte em meio biológico e que poderá apresentar propriedades interessantes para uma aplicação terapêutica. Numa primeira fase deste trabalho, os esforços foram dirigidos no sentido de uma maior compreensão dos mecanismos fundamentais da compactação do ADN após adição de PEI, impondo variações de pH durante a sua preparação. Mais tarde, sob condições selecionadas com base no estudo anterior, o metal foi adicionado, e analisada a sua ação na compactação e descompactação de ADN com recurso a várias técnicas experimentais. Em paralelo, a simulação por Monte Carlo foi utilizada para construir polianiões (simulando ADN) e monitorar modificações na respetiva estrutura impostas pela presença de iões carregados positivamente (simulando o Fe(III)) e policatiões (simulando o PEI). Análises experimentais versus teóricas foram realizadas ao longo do trabalho, a fim de fortalecer as interpretações e os mecanismos propostos. Na segunda parte deste trabalho, com o objetivo de compreender quais as propriedades que regulam as interações no complexo ternário ADN-PEI-Fe(III) foram induzidas alterações em parâmetros tais como, o tamanho e a arquitetura do PEI e a ordem de adição de cada componente na mistura. Em geral, uma teoria consistente surge em que Fe(III) compensa PEI, provavelmente modulando a sua respetiva carga global. Através de dados experimentais e teóricos torna-se evidente que a quelação entre os grupos amina de PEI e o metal demonstra ser um parâmetro crucial para a promoção da condensação de ADN e, consequentemente, na redução do tamanho do complexo final. Numa última fase, estudos in vitro foram realizados para testar a toxicidade e a atividade biológica dos complexos ternários. Em geral, o Fe(III) atenua a toxicidade do complexo, quer pela substituição de moléculas de PEI ou pela diminuição do potencial prejudicial do PEI para as células. Estudos de transfecção revelaram um comportamento não-trivial dos poliplexos ternários, com uma evidente redução da eficiência de transfecção para partículas pequenas, sendo esta menos evidente para complexos de tamanhos superiores. Em suma, o Fe(III), surge como um bom agente auxiliar de condensação com capacidade de modular as propriedades dos complexos de ADN-PEI, incluindo a condensação, estabilidade e toxicidade, sem grande penalidade sobre a sua eficiência de transfecção.

Gene therapy offers promising opportunities for the medical treatment of numerous severe diseases, including cancer. In recent decades, a great deal of effort has been made to develop non-viral biocompatible vectors that enable to overcome several biological barriers. This task becomes very demanding, since this vector has to be sufficiently versatile to adapt to adverse and sometimes contradictory conditions along its trafficking through the cell. Natural and synthetic polymers have been widely used and recognized as efficient vectors for gene administration. Among all, the polyethylenimine (PEI) has been renowned for its high performance. However, the use of this polycation has to be moderate due to its acute toxicity. The main objective of this work is the use of a second agent that presents concomitantly capacity as condensing agent and even the ability to modulate the properties of the DNA-PEI complex. The selected metal was Fe(III) due to their crucial role in living organisms, which consequently makes it a relatively inert compound in biological environment and may present interesting properties for a therapeutic application. In the first phase of this work, efforts have been directed towards a better understanding of the fundamental mechanisms of DNA compaction after addition of PEI, imposing changes in the pH of solutions. Later, under selected conditions based on the previous study, the metal was added and analyzed its action on the condensation and decondensation of DNA using several experimental techniques. In parallel, the Monte Carlo simulation was used to construct a polyanion (simulating DNA) and to monitor changes in the respective structure imposed by the presence of positively charged ions (simulating Fe (III)) and polycations (simulating PEI). Experimental versus theoretical analyzes were carried out throughout the work in order to strengthen the interpretations and proposed mechanisms. In the second part of this work, in order to understand which properties model the interactions in the ternary complex DNA-PEI-Fe(III) were induced changes in parameters such as, the size and architecture of PEI, and in the order of addition of each component to the mixture. In general, a consistent theory arises in which Fe(III) compensates PEI, probably modulating their respective overall charge. Through experimental and theoretical data, it is evident that chelation between the amine groups of PEI and metal proves to be a crucial parameter for the promotion of the condensation of DNA, and consequently, in reducing the complex size of the final complexes. In the final phase, in vitro studies were conducted to test the toxicity and biological activity of ternary complexes. In general, the Fe(III) attenuates the toxicity of the complex, either by replacing PEI molecules or by reducing the harmful potential of PEI to the cells. Transfection studies revealed a non-trivial behavior of ternary polyplexes with a clear reduction of transfection efficiency for small particles, while this fact is less evident for complexes with larger sizes. In conclusion, the Fe(III) acts as a good supporter condensing agent with capacity to modulate the properties of DNA-PEI complexes, including condensation, stability and toxicity, without great penalty on the transfection efficiency.